我們今天看的這篇文章依舊是ceRNA相關(guān)的，作者旨在構(gòu)建一個(gè)lncRNA相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)來探索胃癌(GC)發(fā)生的分子機(jī)制，與之前乳腺癌那篇文章有一些相似，但又有其創(chuàng)新之處。
數(shù)據(jù)和方法 1). 375例胃癌組織和32例癌旁正常組織的mRNASeq數(shù)據(jù)以及446個(gè)GC組織和45個(gè)癌旁組織的miRNAseq與相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)下載自TCGA( June 13, 2018 ); Ensembl數(shù)據(jù)庫用來識別注釋RNAs，將沒有注釋信息的刪除。 2). 將胃癌和正常樣本的lncRNA, mRNA和miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)分別融合成一個(gè)矩陣，刪除無表達(dá)或count均值小于1的行；用R包’edgeR’識別差異RNAs( FDR < 0.01&|log2FC|≥2); 然后用R包“ggplot2”和“pheatmap”繪制差異RNAs的火山圖和熱圖。 3). 用R包“clusterProfiler”對差異mRNAs (DEmRNAs)做GO和KEGG功能注釋，將顯著的前5個(gè)通路可視化。 4). ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建流程如圖1所示，然后為了挖掘潛在的ceRNA調(diào)控軸，剔除ceRNA網(wǎng)絡(luò)中正相關(guān)的lncRNA-miRNA對和miRNA-mRNA對,R包“ggalluvial”將其可視化。5). 54組配對的胃癌臨床樣本由北京醫(yī)院胃腸外科提供；Human gastric epithelial cell line (GES-1)和GC cell lines (MKN-45 and HGC-27)購買自American Type Culture Collection (ATCC, Manassas)，并將其培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染；然后對這些樣本做qRT-PCR。6). 合成含野生型或突變體miR-372結(jié)合位點(diǎn)的CADM2 或ADAMTS9-AS2的3’-UTR序列, 然后用ADAMTS9-AS2/CADM2 3’UTR報(bào)告熒光素酶質(zhì)粒和miR-372 mimics模擬物或miR-NC共轉(zhuǎn)染MKN-45細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性，將螢火蟲熒光素酶正?；癁槟I小球熒光素酶。 7). 下載完TCGA的臨床數(shù)據(jù)后，用R包“survival”做生存分析和統(tǒng)計(jì)顯著性分析。
圖1
結(jié)果 1). 基于TCGA數(shù)據(jù)，總共識別出1,022 差異表達(dá)的DElncRNAs, 104 DEmiRNAs和1,632 DEmRNAs，三種差異RNAs的火山圖如圖2.a所示; 2). 對1,632 個(gè)DEmRNAs的GO和KEGG功能注釋結(jié)果如圖2.b-c，大多與癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)；3). 構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)由41個(gè)DElncRNAs, 9個(gè)DEmiRNAs和10個(gè)DEmRNAs組成，共115條邊(圖3.a)，其中ADAMTS9-AS2(lncRNA)起著重要作用(圖3.b)；然后作者挑選出負(fù)調(diào)控關(guān)系對構(gòu)建調(diào)控軸，包含18個(gè)lncRNAs, 4個(gè) miRNAs和6個(gè)mRNAs(圖3.c)。 4). 對DERNAs的生存分析，識別出7個(gè)lncRNAs( ADAMTS9-AS2, ARHGEF26-AS1, HOTAIR, HOTTIP, LINC00052, NKX2-1-AS1, and VCAN-AS1 )和5個(gè)mRNAs ( CADM2, COL1A1, FAM129A,
SERPINE1, and TMEM100 )與生存期顯著相關(guān)；對ceRNA網(wǎng)中l(wèi)ncRNAs和mRNAs的相關(guān)性分析表明，ADAMTS9-AS2的表達(dá)與CADM2, TMEM100和 FAM129A顯著相關(guān)； 5). ADAMTS9-AS2/miR-372/CADM2作為潛在調(diào)控軸被挖掘出來，ADAMTS9-AS2和CADM2在胃癌樣本中都顯著下調(diào)，而且它們的低表達(dá)與低生存率有關(guān)； 6).實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證: 在54組配對的臨床樣本中，有44組的ADAMTS9-AS2在胃癌樣本中是下調(diào)的；并且在MKN-45和HGC-27兩個(gè)細(xì)胞系中也是低表達(dá)的(前者相對較高)，miR-372在敲除ADAMTS9-AS2的MKN-45細(xì)胞中表達(dá)顯著增加，而在ADAMTS9-AS2過量表達(dá)的HGC-27細(xì)胞中則降低，基因CADM2的表達(dá)水平與之相反；而且miRcode和TargetScan中在ADAMTS9-AS2和CADM2的3’UTR區(qū)域預(yù)測到了miR-372的結(jié)合位點(diǎn)；雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)顯示，miR-372模擬物顯著抑制ADAMTS9-AS2-Wt的相對熒光素酶活性，而ADAMTS9-AS2-Mut未受影響，同時(shí)，野生型CADM2的3’UTR質(zhì)粒的熒光素酶活性在miR-372模擬反應(yīng)下顯著降低，但突變的CADM2 3’ UTR熒光素酶活性也未受影響，表明這一調(diào)控軸關(guān)系確是存在的。
圖2
圖3
總的來說就是作者基于TCGA數(shù)據(jù)，識別出了胃癌相關(guān)的差異RNAs,然后構(gòu)建了lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，并重點(diǎn)挖掘出調(diào)控關(guān)系A(chǔ)DAMTS9-AS2/miR-372/CADM2，然后用多套新的數(shù)據(jù)集加以驗(yàn)證，證實(shí)了其可靠性。
最后，送給大家一句話: Nothing is impossible to a willing heart.
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