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今天和大家分享的是2022年3月1日發(fā)表在Journal for ImmunoTherapy of Cancer（IF：13.751）的一篇文章。看看WGCNA作為一個(gè)成熟且好用的算法是如何在干濕結(jié)合的工作中發(fā)光發(fā)熱的吧！
System analysis based on the cancer–immunity cycle identifies ZNF207 as a novel immunotherapy target for hepatocellular carcinoma
基于癌癥-免疫循環(huán)的系統(tǒng)分析識(shí)別ZNF207為肝細(xì)胞癌的新型免疫治療靶點(diǎn)
摘要
免疫檢查點(diǎn)抑制劑作為晚期肝細(xì)胞癌 (HCC) 的單一療法未能取得令人滿意的結(jié)果，聯(lián)合療法卻顯示出更好的效果。識(shí)別免疫檢查點(diǎn)抑制劑的新聯(lián)合靶點(diǎn)迫在眉睫。作者將癌癥-免疫循環(huán)評(píng)分與加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和系統(tǒng)分析相結(jié)合，篩選出HCC中的免疫抑制靶點(diǎn)：鋅指蛋白207（ZNF207）。作者發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的ZNF207的上調(diào)促進(jìn)了免疫功能正常的小鼠HCC的進(jìn)展，同時(shí)與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)減少和耗竭增加有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明MAPK–CX3CL1軸參與了ZNF207介導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞趨化。此外，ZNF207轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)吲哚胺2，3-雙加氧酶1，使犬尿氨酸的水平升高。作者還發(fā)現(xiàn)ZNF207表達(dá)較低的患者對(duì)PD1治療更敏感，沉默ZNF207可能有利于抗PD1聯(lián)合治療。
背景
肝細(xì)胞癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，然而III期臨床試驗(yàn)中，使用免疫檢查點(diǎn)阻斷劑治療不可切除的肝細(xì)胞癌沒有明顯提升患者的生存效益。幾項(xiàng)初步的大型III期試驗(yàn)使用抗PD1或抗PD-L1藥物聯(lián)合抗CTLA4或抗血管生成藥物，這種療法與索拉非尼單藥療法相比，對(duì)不可切除的肝細(xì)胞癌有更好的生存率。因此，識(shí)別新的免疫檢查點(diǎn)和開發(fā)新的聯(lián)合治療已成為肝細(xì)胞癌免疫治療研究的主要焦點(diǎn)。鋅指蛋白207(ZNF207) 是人類基因組中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，其中ZNF與其他轉(zhuǎn)錄因子或輔助因子結(jié)合在發(fā)育、分化和代謝中發(fā)揮著不同的作用。在本篇文獻(xiàn)中ZNF207作為與預(yù)后不良相關(guān)的因子，能夠與抗PD1聯(lián)合治療肝細(xì)胞癌。
主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)論
ZNF207 是 HCC 中潛在的免疫抑制靶點(diǎn)
為了尋找HCC中潛在的免疫抑制靶點(diǎn)，作者使用TCGA中的HCC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以及從TIP數(shù)據(jù)庫中下載的癌癥-免疫循環(huán)評(píng)分進(jìn)行WGCNA分析。經(jīng)過聚類分析，作者一共得到20模塊。對(duì)所有模塊進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)存在兩個(gè)具有相似內(nèi)部表達(dá)模式的簇（圖1A）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，簇1 中的模塊與癌癥免疫周期的步驟 1-4 呈正相關(guān)，而簇2 中的模塊與步驟 5-7 呈負(fù)相關(guān)（圖1B）。brown和turquoise是簇1和簇2差異最顯著的模塊，為了進(jìn)一步探究?jī)蓚€(gè)模塊的功能，作者將兩個(gè)模塊的基因進(jìn)行Gene Ontology 注釋分析。brown模塊中的基因富集在免疫相關(guān)信號(hào)通路，這些信號(hào)通路與癌癥-免疫循環(huán)的第 1-4 步呈正相關(guān)（圖1C）；turquoise模塊中的基因主要富集在 RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA 剪接和紡錘體組裝過程中，這些過程與癌癥-免疫循環(huán)的第 5-7 步呈負(fù)相關(guān)（圖1D）。為了識(shí)別 HCC 中的免疫抑制靶點(diǎn)，作者專注于turquoise模塊，最后篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的ZNF207（圖1E）。對(duì)22個(gè)臨床HCC樣品進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NF207與CD4、FOXP3、CD11b和CD68之間存在較強(qiáng)的正相關(guān)，與CD8A、C2和C3之間卻存在較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)（圖1F-I）。綜上所述，ZNF207 作為 HCC 潛在的免疫抑制靶點(diǎn)，可能與癌癥-免疫循環(huán)的步驟相關(guān)。
ZNF207在HCC中高表達(dá)并與預(yù)后不良有關(guān)
HCC的進(jìn)展通常會(huì)有基因的異常表達(dá)，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中ZNF207的表達(dá)高于正常樣本（圖2A），Oncomine和GEO數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)也具有同樣的趨勢(shì)（圖2B-C）。ZNF207的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都顯著升高(圖2D-E)。免疫組化(IHC)分析顯示，ZNF207主要在細(xì)胞核中過表達(dá)，與其作為轉(zhuǎn)錄因子的作用一致(圖2F)。在 ZNF207高表達(dá)組中，HCC患者中stageⅢ和Ⅳ、grade3，4和T3，4所占比例更高，同時(shí)與ZNF207低表達(dá)組存在顯著差異（圖 2G），并且在多個(gè)數(shù)據(jù)集中表現(xiàn)出更短的總體生存和無病生存（圖2H）。單變量和多變量COX分析顯示ZNF207是獨(dú)立的預(yù)后因素?？傊?，ZNF207在HCC患者中高表達(dá)，并且與更差的預(yù)后相關(guān)。
在HCC中缺氧會(huì)提高ZNF207表達(dá)水平
作者發(fā)現(xiàn)‘HYPOXIA_VIA_HIF1A_UP’特征在ZNF207high組中顯著富集（圖3A）。在實(shí)驗(yàn)中，作者觀察到物理和化學(xué)模擬缺氧都可以提高ZNF207的蛋白水平（圖3B-C）。BAY87-2243（缺氧誘導(dǎo)因子HIF1α的抑制劑）在缺氧條件下對(duì)ZNF207具有更強(qiáng)的抑制作用（圖3D-E）。在常氧條件下，使用質(zhì)粒過表達(dá)HIF1α和HIF2α，發(fā)現(xiàn)缺氧對(duì)ZNF207的影響可以重現(xiàn)（圖3F-G）。在雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中，缺氧和氯化鈷的培養(yǎng)都增強(qiáng)了ZNF207啟動(dòng)子基因的熒光強(qiáng)度（圖3H）。ChIP-qPCR檢測(cè)顯示，ZNF207啟動(dòng)子區(qū)域有六個(gè)HIF共有結(jié)合位點(diǎn)（圖3I）。在常態(tài)和缺氧條件下，用抗HIF2α抗體免疫沉淀了位于TSS相對(duì)的-1012/-1017 bp的一個(gè)DNA序列（圖3J）。總之，缺氧可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高HCC中ZNF207的表達(dá)。
ZNF207促進(jìn)與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)和衰竭有關(guān)的HCC
作者首先在體外功能喪失和功能獲得實(shí)驗(yàn)中評(píng)估了ZNF207對(duì)細(xì)胞增殖的影響。無論ZNF207敲低(KD)還是ZNF20過表達(dá)（OE），HCC細(xì)胞系的細(xì)胞增殖都保持不變。此外，ZNF207-KD或ZNF207-OE不會(huì)改變免疫缺陷小鼠異種移植腫瘤的生長(zhǎng)速度（圖4A-B）。ZNF207-KD或ZNF207-OE處理 Hepa1-6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)會(huì)明顯影響腫瘤的生長(zhǎng)速度，但在體外沒有顯示出細(xì)胞增殖的差異（圖4C-D）。在ZNF207-KD或ZNF207-OE中，腺相關(guān)病毒8顯著改變了免疫功能正常的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)（圖4E）。這些發(fā)現(xiàn)表明ZNF207誘導(dǎo)的HCC進(jìn)展與腫瘤免疫有關(guān)。通過流式細(xì)胞術(shù)分析，ZNF207-KD增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)并抑制其耗竭（圖4F）。使用條件培養(yǎng)基在體外模擬ZNF207對(duì)T細(xì)胞功能的影響。從ZNF207-KD Hepa1-6細(xì)胞獲得的條件培養(yǎng)基對(duì)自然殺傷細(xì)胞、B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞沒有顯著的趨化作用，而對(duì)CD8+ T細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的趨化作用（圖 4G）。ZNF207與TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中耗盡的T細(xì)胞基因特征和免疫檢查點(diǎn)分子呈正相關(guān)，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致（圖4J-K）。綜上所述，ZNF207通過腫瘤免疫促進(jìn)HCC進(jìn)展，這與CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)和耗竭相關(guān)。
ZNF207通過MAPK-CX3CL1軸抑制CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)
為了闡明ZNF207影響CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)和耗竭的潛在機(jī)制，對(duì)Hepa1-6-shZNF207和Hepa1-6-shNC細(xì)胞進(jìn)行了RNA測(cè)序分析。GSEA分析顯示免疫和代謝相關(guān)信號(hào)通路在ZNF207-KD組中顯著富集（圖5A）。趨化因子、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和T細(xì)胞受體信號(hào)通路被上調(diào)（圖5B）。作者通過細(xì)胞因子陣列來比較Hepa1-6-shZNF207和Hepa1-6-shNC細(xì)胞的細(xì)胞上清液和裂解物中的 111 種細(xì)胞因子，CX3CL1與T細(xì)胞趨化密切相關(guān)，而且在上清液和裂解物中具有一致的趨勢(shì)（圖5C），因此作者主要關(guān)注CX3CL1。作者通過ELISA證實(shí)了細(xì)胞上清液中CX3CL1的上調(diào)（圖5D）。此外，在人類HCC樣本中觀察到ZNF207和CX3CL1之間存在強(qiáng)負(fù)相關(guān)（圖5E）。當(dāng)用CX3CL1中和劑處理時(shí)，條件培養(yǎng)基對(duì) CD8+ T 細(xì)胞的趨化作用減弱（圖5F）。生存分析顯示，CX3CL1低ZNF207高組的患者總生存率（OS）最差，HR最高，而CX3CL1高ZNF207低組的生存結(jié)果最好（圖5G）。以上研究表明，CX3CL1在ZNF207介導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)和HCC進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。GSEA分析表明，MAPK信號(hào)通路在 ZNF207-KD 組中顯著富集（圖 5A，H）。實(shí)驗(yàn)證明，p38MAPK抑制劑 (SB203580) 可以直接抑制Hepa1-6細(xì)胞中的CX3CL1，并且ZNF207-KD對(duì)CX3CL1的過表達(dá)也可以被SB203580逆轉(zhuǎn)（圖5I-J）。通過上述的工作，作者發(fā)現(xiàn)ZNF207可能通過MAPK-CX3CL1軸抑制CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)。
ZNF207通過提高犬尿氨酸水平促進(jìn)CD8+T細(xì)胞衰竭
之前的結(jié)果顯示除了免疫通路外還在代謝相關(guān)通路顯著富集，作者假設(shè)ZNF207 可能影響腫瘤代謝以調(diào)節(jié)CD8+ T細(xì)胞功能。通過對(duì)Hepa1-6-shZNF207和 Hepa1-6-shNC細(xì)胞的代謝組學(xué)分析，作者驗(yàn)證了富集分析的結(jié)果；并且ZNF207-KD 后各種代謝物下調(diào)，其中氨基酸是差異代謝物的最大成分（圖6A）。KEGG和GO富集分析顯示，差異代謝物在色氨酸代謝通路中顯著富集。ZNF207-KD 后，色氨酸代謝通路中的代謝物水平，包括犬尿氨酸的水平，被顯著抑制（圖6B）。正如預(yù)期的那樣，ZNF207-KD 抑制了細(xì)胞上清液中的犬尿氨酸水平，ZNF207-OE呈現(xiàn)相反的現(xiàn)象（圖6C）。已有研究表明，腫瘤細(xì)胞釋放的犬尿氨酸可誘導(dǎo) T細(xì)胞耗竭，這解釋了ZNF207如何促進(jìn)HCC中CD8+ T細(xì)胞耗竭的部分機(jī)制。作者將犬尿氨酸添加到 ZNF207-KD 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中以監(jiān)測(cè) CD8+ T 細(xì)胞耗竭，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示犬尿氨酸補(bǔ)充劑顯著誘導(dǎo) CD8+ T 細(xì)胞耗竭（圖6D）。綜上所述，犬尿氨酸參與了ZNF207介導(dǎo)的CD8+ T細(xì)胞耗竭。
ZNF207 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) IDO1 以促進(jìn)犬尿氨酸的產(chǎn)生
為了進(jìn)一步探究ZNF207是如何改變?nèi)虬彼岽x，作者關(guān)注犬尿氨酸代謝通路中的關(guān)鍵基因，這些基因在ZNF207-KD組中顯著下調(diào)。ZNF207表達(dá)僅提高 IDO1的mRNA水平，但不提高IDO2或TDO2。基于這些發(fā)現(xiàn)，作者提出假設(shè)：ZNF207可以轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)IDO1。為了驗(yàn)證假設(shè)，作者進(jìn)行雙熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果表明，當(dāng)IDO1啟動(dòng)子-熒光素酶質(zhì)粒與ZNF207-OE質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)，熒光強(qiáng)度增加（圖6E）。ChIP-qPCR證實(shí)ZNF207可以結(jié)合IDO1啟動(dòng)子的三個(gè)區(qū)域（圖6F）。用特異性抑制劑PF-06840003抑制IDO1，可逆轉(zhuǎn)由ZNF207表達(dá)介導(dǎo)的犬尿氨酸水平（圖 6G）。此外，PF-06840003治療逆轉(zhuǎn)了由來自 ZNF207-OE 細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基引起的CD8+ T 細(xì)胞衰竭（圖6H）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，PF-06840003 治療逆轉(zhuǎn)了ZNF207-OE的促腫瘤生長(zhǎng)作用，IDO1通路在ZNF207介導(dǎo)的 HCC 生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。這篇文章初步證明了ZNF207可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)IDO1來提高犬尿氨酸并誘導(dǎo)CD8+ T細(xì)胞衰竭。
ZNF207是與抗PD1療法相結(jié)合的潛在治療靶點(diǎn)
通過上述的工作發(fā)現(xiàn)，ZNF207可以通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫來促進(jìn)HCC的進(jìn)展，在本節(jié)工作中將致力于研究ZNF207與抗PD1療法相結(jié)合治療HCC患者的潛力。雖然單獨(dú)抗PD1治療可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，但ZNF207-KD聯(lián)合PD1單克隆抗體表現(xiàn)出突出的腫瘤抑制效果（圖7A-C）。ZNF207-KD加抗PD1治療組的PCNA陽性細(xì)胞百分比最低，而浸潤(rùn)性T細(xì)胞明顯增加（圖7D）。接下來作者采用TIDE和Submap算法來預(yù)測(cè)TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中不同ZNF207表達(dá)的患者的免疫治療反應(yīng)率（圖7E）。ZNF207高表達(dá)組中只有21.6%的患者對(duì)免疫治療有反應(yīng)，而 ZNF207低表達(dá)組有70.3%的患者有反應(yīng)（圖 7F）。此外，與CTLA-4單克隆抗體相比，ZNF207低表達(dá)組患者對(duì)PD1單克隆抗體治療的反應(yīng)更好（圖 7G）。綜上所述，ZNF207可以作為一種生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，結(jié)合抗PD1療法治療HCC。
總結(jié)
在這個(gè)工作中先利用生物信息學(xué)方法篩選基因，然后通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探索ZNF207在HCC中的作用，并使用公共數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)ZNF207作為聯(lián)合治療靶點(diǎn)的潛力。眾多的基因中如何找到最關(guān)鍵的那一個(gè)，逐一用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證大大增加了我們實(shí)驗(yàn)的成本。我們可以明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇合適的方法，結(jié)合生物信息手段，快速鎖定目標(biāo)，讓我們的工作少走彎路！
