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大家好！今天跟大家分享的文獻是2022年1月發(fā)表在Frontiers in Cell and Developmental Biology（2022年IF=5.85）雜志上的一篇文章。文中涉及TCGA頭頸部腫瘤（HNSCC）隊列（TCGA- HNSCC）和GEO頭頸部腫瘤隊列（GEO- HNSCC）兩個研究隊列，鑒定出與HNSCC患者的預后，纖維化，缺氧，糖酵解相關基因signatures?？靵砜纯催@么多表型，作者是怎么設計嵌套的吧。
背景介紹：
成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GFs) 是一類多功能多肽生長因子家族，至少有28個不同的成員，典型的FGF通過結(jié)合并激活酪氨酸激酶FGF受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)，觸發(fā)生物活性有關的細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應。在胚胎發(fā)育過程中，F(xiàn)GF通過調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和遷移在形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮關鍵作用。在成人中，F(xiàn)GF作為穩(wěn)態(tài)因子參與調(diào)控組織修復和傷口愈合、神經(jīng)系統(tǒng)控制和腫瘤血管生成等。
FGFRs是免疫球蛋白(Ig)超家族的跨膜酪氨酸激酶受體，它們各自被高親和力FGF配體激活導致激酶激活，從而導致細胞內(nèi)信號網(wǎng)絡的激活。在人類中，F(xiàn)GFR家族由4種跨膜受體酪氨酸激酶(RTKs）組成，即FGFR1到FGFR4。FGFRs作為抗腫瘤最有潛力的靶點之一，目前已有多個臨床試驗檢驗FGF/FGFR相關藥物的抗腫瘤作用。
缺氧作為一個相對上游的事件，可以通過影響下游事件，進而影響疾病的發(fā)生發(fā)展及治療。如腫瘤微環(huán)境中存在時空梯度的氧擴散和消耗，導致多數(shù)實體腫瘤的亞區(qū)具有低水平的分子氧，即為缺氧。這些區(qū)域的大小和范圍各不相同，它們的出現(xiàn)是由于供氧減少(腫瘤血管紊亂和不規(guī)則)或耗氧增加(腫瘤代謝變化)。腫瘤對這種氧供需失衡的適應與不良臨床預后、基因組不穩(wěn)定性升高、化療和放療耐藥性升高、免疫抑制、腫瘤干細胞保護生態(tài)位發(fā)育和遠處轉(zhuǎn)移傾向增加相關。
正常細胞體內(nèi)，葡萄糖會維持一個平衡狀態(tài)，在缺氧狀態(tài)時，葡萄糖會轉(zhuǎn)變丙酮酸進而轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，當氧含量正常時，丙酮酸會進入三羧酸（TCA）循環(huán)。而腫瘤細胞的一個普遍特點是即使在氧含量正常的情況下，葡萄糖攝取量和乳酸的積累量也會逐漸升高，利用糖酵解作為主要能量代謝的來源，獲得更高的糖分解能力，使得葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗醽懋a(chǎn)生ATP，這種現(xiàn)象我們稱為Warburg效應。Warburg效應代表著腫瘤細胞對葡萄糖利用方式由氧化磷酸化到糖酵解的轉(zhuǎn)變，現(xiàn)在被認為是腫瘤一大特征。
流程圖
結(jié)果
1. HNSCC纖維化信號及與纖維化相關的DEGs
70個與FGFR信號通路呈正相關的基因被用于評估患者纖維化信號激活狀態(tài)。
基于UMAP算法，作者使用纖維化相關表達矩陣將患者分為兩個cluster，將每個患者分配到最近的cluster (圖2A)。Kaplan Meier圖表明，兩個cluster之間存在顯著差異(圖2B)。cluster 1和cluster 2分別有309例和176例患者。
為了獲得纖維化相關的DEGs，我們比較了cluster間的表達譜。在cluster1中，總共有187個與纖維化相關的DEGs過表達，在cluster1中，患者的預后較差，DEGs富集分析顯示在response to wounding(圖2C)， TGF - β信號通路富集(圖2D)。這意味著cluster 1的患者處于更高的纖維化激活狀態(tài)。富集分析顯示，在cluster2中過表達的186個DEGs中富集在immunoglobulin complex (圖2E)，metabolism of xenobiotics cytochrome P45 0(圖2F)。提示免疫狀態(tài)良好的患者預后較好。
2. HNSCC的缺氧狀態(tài)、糖酵解狀態(tài)和缺氧糖酵解相關的DEGs
接下來作者利用GSVA包的ssGSEA算法來量化每個HNSCC患者缺氧或糖酵解富集評分（缺氧或糖酵解基因集來自MSigDB）。為了解缺氧和糖酵解對HNSCC患者預后的影響，對HNSCC缺氧和糖酵解評分進行單因素Cox回歸分析。如圖3A的森林圖所示，缺氧和糖酵解是HNSCC患者預后的危險因素。作者根據(jù)缺氧(圖3B)和糖酵解(圖3C)評分將患者分為兩組。將缺氧和糖酵解狀態(tài)合成為一個二維指數(shù)，將患者分為三組，即高缺氧/糖酵解高組、低缺氧/糖酵解低組和混合組。三組間的生存率有顯著差異(圖3D)。高缺氧/糖酵解高組的OS優(yōu)于低缺氧/糖酵解低組(圖3E)。
高缺氧/糖酵解高和低缺氧/糖酵解低組的差異分析提示，缺氧糖酵解相關DEGs共108個
3. TCGA數(shù)據(jù)集中纖維化缺氧糖酵解相關預后模型的構(gòu)建
將上述從HNSCC中鑒定出的334個與纖維化相關的DEGs和108個與缺氧糖酵解相關的DEGs取交集，得到39個關鍵基因(圖4A)。為了進一步篩選預后相關的DEGs，作者取cox分析中21個預后顯著相關的基因(圖4B)。其中18個基因的風險值較高。LASSO回歸從上述21個預后DEGs中選取6個關鍵基因，其中4個高風險因素, 2個為保護因素 (圖4C,D)。對于每個HNSCC患者，根據(jù)6個關鍵基因的表達水平和LASSO Cox回歸的相應系數(shù)計算風險評分，根據(jù)患者的風險評分將患者分為高、低風險組(圖4E)。低危組預后優(yōu)于高危組(圖4F)。
4. 預后模型及其與免疫細胞浸潤關系的補充信息
作者根據(jù)風險評分分組，對483例HNSCC患者進行了生存分析。根據(jù)原發(fā)腫瘤的位置進行了亞組分析。在舌和咽喉(圖5B,D)，發(fā)現(xiàn)高危組患者預后較差。扁桃體、下咽同樣(圖5A、C)。單因素Cox回歸分析顯示，風險評分可作為評估HNSCC患者預后的獨立危險因素(圖5E)。
作者還利用ssGSEA算法評估患者的免疫細胞浸潤水平。作者對6個基因與免疫細胞浸潤評分之間進行了相關性分析(圖5F)。與低危組相比，高危組的患者8個特異性免疫細胞的浸潤水平顯著減少，包括活化的B細胞、未成熟B細胞、活化的CD4 + T細胞、活化的CD8 + T細胞、效應記憶CD8 + T細胞、MDSCs和肥大細胞(圖5G)。
5. GEO數(shù)據(jù)集中纖維化缺氧糖酵解相關預后模型的外部獨立隊列驗證
作者上述 分析確定了纖維化+缺氧+糖酵解為基礎的預后模型在獨立隊列GSE41613中得到進一步驗證。在97例OSCC患者的表達矩陣中，有5個模型中的基因?；颊吲R床資料如表2所示。
單變量Cox回歸結(jié)果提示AREG、THBS1、SEMA3C、ANO1獨立危險因素。而EPHX3是保護因素，與作者利用TCGA建議的模型一致(圖6A)。作者根據(jù)基因表達水平將患者分為兩組(圖6B、D、F、H、J)，并進行生存分析(圖6C、E、G、I、K)。Kaplan Meier曲線顯示，預后模型中4個風險基因表達水平較高的患者OS較差(圖6C,E,G,I)，而保護基因表達水平相反(圖6K)。
6. 預后模型的免疫組化分析（HPA+自有石蠟切片）
為了進一步驗證預后模型中基因表達，作者對頭頸部鱗狀細胞癌石蠟切片進行了免疫組化染色分析。免疫組化染色分析顯示，抗體ab135842(圖7A F)和ab134050(圖8A F)定量的HNSCC組織中SEMA3C和IGHG2的表達略高。根據(jù)HPA的蛋白表達數(shù)據(jù)，我們比較了6基因簽名蛋白在頭頸部HNSCC組織和鱗狀上皮(口腔鱗狀上皮)中的表達。發(fā)現(xiàn)這些基因的蛋白表達在HNSCC和正常組織中存在差異。
7. 基于scRNA-Seq的HNSCC患者纖維化相關免疫圖譜
為了進一步了解纖維化信號與免疫的相關性，作者分析了GEO數(shù)據(jù)集GSE139324的scRNA-seq數(shù)據(jù)。共使用23個樣品進行分析。其中，18個樣本為來自HNSCC患者的腫瘤組織浸潤免疫細胞，5個樣本為來自健康供體扁桃體的組織內(nèi)免疫細胞，分類為20個細胞簇。此外，在HNSCC患者和健康供體(HD)之間，每個細胞亞群的數(shù)量有顯著差異(圖9A)。
通過多種細胞表面和細胞內(nèi)標記物的表達，cluster 4和cluster 11被定義為單核細胞。cluster 3、cluster 9、cluster 13、cluster 14和cluster 20表達與B細胞相關的標記物 (如CD79A)，其余cluster表達與T細胞相關的基因(如CD3D) (圖9B)。
圖9C、D分別顯示低OS患者中FGF受體信號相關基因高表達和DEGs高表達的細胞，其中大部分在cluster 4和cluster 11中高表達。與健康對照組相比，患者的單核細胞組成明顯更高(圖9E)。在HNSCC和HD中，cluster 4和cluster 11的細胞數(shù)量有顯著差異(圖9F,G)。熱圖表明上述基因在單核細胞中比在其他種類的免疫細胞中更豐富(圖9H)。
總結(jié)
作者通過差異分析，將FGFR信號通路相關的基因、缺氧相關的基因和糖酵解相關的基因整合建立一個預后模型，在TCGA-HNSCC患者的預后相關，并利用GEO-HNSCC驗證模型的效能。單細胞分析內(nèi)容，將模型中的基因與單核細胞建立聯(lián)系。多個表型，聯(lián)合單細胞分析，故事講的完整。
這里有兩個值得我們思考的地方：
1.作者在用外部數(shù)據(jù)集驗證模型的時候，其中有1個基因沒有被鑒定出來。所以作者做了其余5個基因的生存分析進行驗證。這種情況，小編以前也遇到過，通過機器學習得到的模型中的基因，并沒有在驗證集中找到，最后只能放棄這個模型。這次看到作者單個基因驗證的方法也可以將論文發(fā)表出來，以后也可以效仿一下哈；
2.FGFR聯(lián)系到缺氧、糖酵解，不同于基因集的分析套路，相當于三個表型，可以又多個組合模式，生信的挖掘深度越來越吃專業(yè)背景了，吸人眼球的思路還是得聽需要專業(yè)人士來擺一擺哦~
1. Shi M, Zhu J, Wang R, et al. Latent TGF-β structure and activation. Nature. 2011;4747351:343-349.
2. Annes JP, Chen Y, Munger JS, Rifkin DB. Integrin alphaVbeta6-mediated activation of latent TGF-beta requires the latent TGF-beta binding protein-1. J Cell Biol. 2004;1655:723-734.
3. Ge G, Greenspan DS. BMP1 controls TGFbeta1 activation via cleavage of latent TGFbeta-binding protein. J Cell Biol. 2006;1751:111-120.
