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導讀
單細胞RNA測序(scRNA-seq)在單細胞水平上促進對復雜細胞混合的腫瘤的研究。然而，用scRNA-seq技術分析人類組織也是具有挑戰(zhàn)性的，因為不可能將完整的細胞從這些現(xiàn)有的固體組織活檢中分離出來。單細胞核RNA（snRNA-seq）測序技術克服了這些技術挑戰(zhàn)，隨著scRNA-seq和snRNA-seq技術的改進，它們在組織中的用途已越來越大。
背景知識
目前已經(jīng)在肝癌中發(fā)現(xiàn)了多種癌癥基因，包括腫瘤抑制基因的突變，如腫瘤蛋白P53(TP53)。然而，我們尚不清楚這些體細胞突變是否與肝細胞癌的細胞類型變化有關。為了解決這一問題并闡明相關細胞類型的分子機制，下文作者利用scRNA-seq/snRNA-seq聯(lián)合bulk-seq發(fā)現(xiàn)并分析了一種與肝癌風險相關的細胞類型，Prol，以補充已知的體細胞癌突變。利用體細胞突變分析，作者還發(fā)現(xiàn)體細胞的TP53和RB1突變與肝細胞癌中Prol的增殖有關。下面我們來具體看一下這篇文章吧！
結果解讀：
作者利用相關的RNA-seq數(shù)據(jù)集:從非酒精性脂肪肝相關肝細胞癌患者的肝癌組織和鄰近非腫瘤肝活檢組織的肝臟snRNA-seq數(shù)據(jù)集；肝細胞癌、鄰近的非腫瘤組織和正常肝臟樣本的肝臟scRNA-seq數(shù)據(jù)集；利用TCGA數(shù)據(jù)庫和肝癌研究所(LCI)的肝細胞癌和癌旁組織的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集。另外，作者還在TCGA和LCI隊列中描述了細胞類型（與肝細胞癌增加相關）對生存結果的影響。最后，作者尋找體細胞突變與肝細胞癌中增加的細胞類型比例估計之間的聯(lián)系。
為了分解TCGA和LCI隊列中的肝臟bulk RNA-seq細胞類型，作者首先建立了一個單細胞水平的參考數(shù)據(jù)集。作者利用snRNA-seq或scRNAseq生成的三個單細胞水平的隊列來構建參考數(shù)據(jù)集。為了識別相同的細胞類型并糾正這些批次效應，作者使用CCA方法(canonical correlation analysis,典型相關分析)整合了這些單細胞水平的表達數(shù)據(jù)，該方法可以在減少技術差異的同時保留生物意義的信號，綜合數(shù)據(jù)使用Seurat進行分類，結果識別出25種細胞類型(圖2a、b)。
根據(jù)它們的譜系，將識別的25種亞細胞類型合并為8個主要細胞類型(圖2a)。根據(jù)已知標記基因的表達和富集的通路對亞細胞類型和主細胞類型進行分類(圖2c)。然后作者在HCC中檢測富集或耗竭的亞細胞類型/細胞類型(圖2d)。作者觀察到一種新的細胞類型群中腫瘤細胞顯著富集(80.4%)，作者將其命名為增殖性(Prol)細胞型(圖2d，e)。接下來，作者探索了Prol細胞類型中的標記基因，以進一步了解其生物學特性。作者發(fā)現(xiàn)了三個基因，HMGN2，RARRES2和HIST1H4C，這些基因以前在其他惡性腫瘤中被描述過，但在肝細胞癌中沒有。其中兩個，HIST1H4C和HMGN2，是與核小體DNA結合的核蛋白，與Prol具有更高的S和G2M得分一致(圖2 f，g)?？傮w而言，單細胞水平的參考數(shù)據(jù)表明Prol細胞類型與肝細胞癌相關。
接下來，作者在單細胞水平上驗證細胞類型組成變化是否在肝癌中普遍存在。因此，作者計算了TCGA肝細胞癌(TCGA-LIHC)隊列中8種主要細胞類型和25種亞細胞類型的細胞類型比例。在8種細胞類型中，作者發(fā)現(xiàn)在49例肝癌中，只有Prol顯著增加，而在腫瘤中有5種細胞類型顯著減少(圖3a。T、Myel、Chol、B、Hep簇)。Prol豐度的增加與單細胞水平上觀察到的數(shù)據(jù)結果一致(圖3a和圖2d)。為了復現(xiàn)作者在TCGA隊列中發(fā)現(xiàn)的細胞類型差異，作者研究了LCI隊列，該隊列主要由亞洲肝細胞癌患者組成（HBV-HCC）。在LCI和TCGA隊列中，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤和非腫瘤組織之間的細胞類型變化相似(圖3b)。 在LCI隊列中，只有Prol細胞類型在肝癌中顯著增加(圖3b)，而髓系、T和Hep簇在TCGA和LCI中都顯著減少，其中Hep下降最大。然后，作者通過分析bulk肝臟數(shù)據(jù)中腫瘤和鄰近非腫瘤之間的基因表達，來驗證觀察到的HCC中ProL比例估計的增加。與其他細胞類型相比，Prol簇的標記基因在TCGA和LCI隊列中表達最高(圖3c、d)。另外，作者發(fā)現(xiàn)，當使用TCGA中腫瘤上調(diào)基因時，來自Prol的細胞/核具有最高的bulk tumor scores (圖3e-h)。綜上所述，Prol標記基因在實體HCC組織水平的顯著增加，并且，實體腫瘤中的上調(diào)基因在Prol細胞類型中的表達最高，。
為了確定Prol細胞類型對TCGA患者生存結果的臨床意義，作者評估了它對361名HCC患者的總生存期(OS)和無進展間期(PFI)的影響。作者使用中位數(shù)將HCC患者分成低和高細胞比例兩組，在TCGA中，兩組OS和PFI的風險比都在1以上（圖 4a、b)。作者分析了標記的基因表達與生存結果之間的關系。作者觀察到，與其他細胞類型相比，高比例的Prol特異性標記基因?qū)S和PFI的風險比大于1（圖4 d，e)。另外，作者發(fā)現(xiàn)Prol核/細胞的OS平均下降率最高（圖4g、h和圖4j，k)）。同樣作者在LCI隊列中也得出相同的結果(圖4i)。作者強調(diào)了Prol細胞類型與不良生存預后相關?？傮w而言，基于bulk的單細胞水平的研究結果表明，Prol核/細胞顯著過度表達tumor-elevated bulk DE基因(圖4e-h)和survival-decreasing bulk的DE基因(圖4 g-l)，該結果進一步證實了Prol細胞類型與肝細胞癌和較差生存率的關聯(lián)。
作者仍然不清楚體細胞突變是否會導致特定的腫瘤細胞類型的擴張或耗竭。因此，作者分析了細胞類型特征與69個顯著突變基因突變之間的關系。作者確定了3個與較高的細胞類型豐度相關的基因。其中，TP53和RB1突變導致Prol腫瘤細胞類型的預測比例顯著增加(圖5a)。此外，在攜帶TP53突變或RB1突變的個體中，Prol是唯一顯著增加的細胞類型(圖5b)。已知TP53中的許多突變會導致P53的腫瘤抑制功能喪失，從而導致細胞生長失控。作者觀察到，TP53錯義、移碼和無義突變導致Prol的比例顯著增加(圖5c)。雖然移碼和無義突變可能導致功能的完全喪失，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TP53的錯義突變主要發(fā)生在蛋白質(zhì)的DNA結合區(qū)域，也導致其腫瘤抑制功能的喪失。為了進一步研究Prol細胞類型是否是TP53突變的主要結果，作者鑒定了TCGA數(shù)據(jù)中TP53突變患者和TP53野生型患者間的差異表達基因，然后根據(jù)在TP53突變組中差異上調(diào)基因計算單細胞水平數(shù)據(jù)中各種細胞類型的TP53突變得分。發(fā)現(xiàn)Prol細胞/核的TP53突變分數(shù)顯著高于其他所有細胞/核(圖5d，f)。對于RB1突變作者用了同樣方法進行分析，發(fā)現(xiàn)了類似的結果?？傊@些結果表明，不同的體細胞突變可以導致腫瘤細胞的擴張，并突出了TP53突變在增殖和失控的細胞生長中的作用。
全文總結：
snRNA-seq相比scRNA-seq在樣本豐富度上更有優(yōu)勢，不再僅局限于新鮮樣本，也適合與一些難解離樣本。雖然snRNA-seq有這樣優(yōu)勢，但并不意味著snRNA-seq就可以完全替代scRNA-seq，首先snRNA-seq檢測的是細胞核中的RNA，檢測到的RNA數(shù)量還是少于整個細胞可以檢測到的數(shù)量；其次對于某些細胞類型，scRNA-seq可以獲得更多的免疫細胞,而snRNA-Seq得到更多的惡性腫瘤細胞分型?？偠灾?，snRNA-seq與scRNA-seq兩種方法各有優(yōu)劣，整合snRNA-seq、scRNA-seq和bulk RNA-seq數(shù)據(jù)可以很全面的探究疾病的細胞類型差異。
參考文獻
1 Alvarez, M. et al. Human liver single nucleus and single cell RNA sequencing identify a hepatocellular carcinoma-associated cell-type affecting survival. Genome Med 14, 50, doi:10.1186/s13073-022-01055-5 (2022).
