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小編今天給大家解讀一篇最近發(fā)表在Journal of Thoracic Oncology雜志（IF: 20.121）上的文章,題目是“Single cell analysis reveals transcriptomic features of drug tolerant persisters and stromal adaptation in a patient-derived EGFR-mutated lung adenocarcinoma xenograft model”。
靶向治療需要終生治療，因為停藥會導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)主要是由在細(xì)胞毒性藥物作用下存活的少數(shù)耐藥持久性（DTP）細(xì)胞亞群驅(qū)動的。在肺癌方面，DTP的研究主要是通過細(xì)胞系模型進(jìn)行的。作者使用一種由表皮生長因子受體(EGFR)突變驅(qū)動的肺腺癌(LUAD)患者來源的異種移植瘤(PDX)進(jìn)行了體內(nèi)DTP研究。每天用EGFR抑制劑erlotinib治療荷瘤小鼠5-6周后，腫瘤明顯縮小，并產(chǎn)生DTP，通過全外顯子組、批量群體轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)進(jìn)行分析。DTP可能起源于特定的預(yù)先存在的癌細(xì)胞亞群，其激活了特定的耐藥途徑。TKI治療誘導(dǎo)DTP表現(xiàn)出這些通路的更強激活，同時將主要的先前存在的CAF群體轉(zhuǎn)換到一種新的狀態(tài)，這可能進(jìn)一步促進(jìn)DTP的生存。
厄洛替尼縮小PHLC137 PDX腫瘤，治療1個月后進(jìn)入最小殘留病(MRD)狀態(tài)(圖1A)。由于證實MRD含有尚未發(fā)展到獲得性耐藥的DTP，當(dāng)TKI治療停止時，腫瘤會重新出現(xiàn)，并對藥物產(chǎn)生反應(yīng)?；A(chǔ)治療和厄洛替尼治療的DTP腫瘤顯示粘液分化，表明DTP沒有去分化。DTP腫瘤還表現(xiàn)出間質(zhì)纖維化增加(圖1B)，類似于新輔助EGFR TKI治療后EGFR突變的肺癌，并顯示Ki67表達(dá)降低(圖1C,D)。
DTP和未經(jīng)治療的（BL）腫瘤在外顯子突變、拷貝數(shù)改變或亞克隆結(jié)構(gòu)(圖2A,B)方面沒有差異。因此，在厄洛替尼治療后，沒有出現(xiàn)遺傳上不同的耐藥亞克隆。識別了DTP中相對于BL的1051個DEG。(圖2C)。使用Hallmark基因集的GSEA發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的DTP DEGs在細(xì)胞周期、E2F和MYC活性方面富集，與DTP Ki67表達(dá)降低一致。上調(diào)的DTP DEGs在NF-кB通路激活方面富集最多(圖2D)。上調(diào)最多的DTP基因是APOE(圖2C)。APOE在腦和肺損傷期間上調(diào)，以防止由EGFR TKIs觸發(fā)的氧化損傷。MUC5AC也與其他幾種黏蛋白一起上調(diào)，支持DTPs維持或增加粘液譜系分化。此外，幾種乙醇脫氫酶(ALDHs)有較高水平表達(dá)，這可能有助于DTPs耐受TKI產(chǎn)生的活性氧。為了確定DEG是否轉(zhuǎn)化為可以標(biāo)記DTP狀態(tài)的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，對兩個上調(diào)的DTP基因ECM1和AKAP12進(jìn)行了IHC。這兩種蛋白在DTP腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)高于在BL腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)(圖2E和F)。
scRNA-seq分析了約3000個高質(zhì)量的BL癌細(xì)胞，但從顯微鏡下的DTP腫瘤中只獲得了94個高質(zhì)量的細(xì)胞，這與它們的MRD性質(zhì)一致。結(jié)合BL和DTP數(shù)據(jù)顯示了7個簇(圖3A,B)。簇6包括77%的DTP和4%的BL細(xì)胞。由于該聚類包含了大部分的DTPs，將簇6中的122個BL細(xì)胞標(biāo)記為DTPL。在偽時序分析中，腫瘤細(xì)胞沿三部分軌跡分布(圖3C)。所有DTPs都只出現(xiàn)在單一狀態(tài)的末端，表明處于穩(wěn)定狀態(tài)。大多數(shù)DTPs和DTPL細(xì)胞在同一狀態(tài)的末端緊密聚集在一起，而一些DTPL細(xì)胞位于骨干路徑上，提示存在過渡狀態(tài)。DTP或DTPL細(xì)胞的偽時序值最高，BL細(xì)胞的偽時序值最低，說明從BL到DTPL再到DTP的過渡過程。該分析支持DTPL細(xì)胞不僅與DTPs相似，而且可能是DTPs的前體(圖3C)。
在簇6內(nèi)，99%的DTP和97%的DTPL細(xì)胞處于G1，而其他簇中，95%的DTP和48%的BL細(xì)胞處于G1(圖3D)。因此，DTPL細(xì)胞共享DTPs減少的周期分布。為了進(jìn)一步研究DTPs和DTPL細(xì)胞之間的相似性，從scRNA-seq數(shù)據(jù)中鑒定了相對于BL細(xì)胞的DEG。對于DTPL細(xì)胞，相對于簇6之外的BL細(xì)胞，鑒定出524個DEGs; 70%的DTPL DEGs也是DTP DEGs(圖3E)，這進(jìn)一步支持了它們的相似性。
接下來，探索了其他肺癌模型和患者DTPs中升高的基因。據(jù)報道，來自Hallmark基因集的脂肪酸代謝(FAM)和活性氧(ROS)特征在奧希替尼處理PC9細(xì)胞后產(chǎn)生的DTPs中更高; 兩種特征評分在簇6之外的BL細(xì)胞中低，而在DTPs細(xì)胞中最高(圖3F)。使用包含EGFR和其他驅(qū)動突變的腫瘤細(xì)胞隊列，使用各自的激酶抑制劑治療，肺泡signature和一組629個基因，與治療na?ve腫瘤(RD標(biāo)記)相比，在殘留疾病中差異過表達(dá)。這些基因在BL細(xì)胞中表達(dá)量低，在DTPL細(xì)胞中表達(dá)量居中，在DTPs中表達(dá)量高(圖3F)?？偟膩碚f，DTPs和DTPL細(xì)胞在G1細(xì)胞周期階段相似地富集，共享多個基因和signature表達(dá)譜，據(jù)報道在其他DTPs或治療后殘留腫瘤中過表達(dá)，并通過軌跡和偽時間分析提示其發(fā)育相關(guān)。
通過scRNA-seq，在DTPs中富含的top DEG是ECM1，并被證實在一小部分BL腫瘤細(xì)胞中在蛋白質(zhì)水平上表達(dá)(圖2E,F)。免疫組織化學(xué)方法檢測了ECM1在治療初期切除的具有EGFR突變的原發(fā)LUAD中的表達(dá)。所有病例中有71%有ECM1的表達(dá)，其中大多數(shù)有罕見或局灶性表達(dá)。
使用常見的“高置信度”DTP DEG，帶有Hallmark基因集的GSEA仍然將NF-кB確定為最高上調(diào)途徑，而E2F、細(xì)胞周期和MYC仍然是DTP中最高下調(diào)途徑(圖4A)。通過量化另一個由EGFR突變的肺癌細(xì)胞中的直接靶點組成的NF-кB信號的表達(dá)，證實了NF-кB的發(fā)現(xiàn)。這一特征在DTP細(xì)胞中最高，在DTPL細(xì)胞中居中，在BL細(xì)胞中最低(圖4C)。
接下來，對ENCODE和ChEA轉(zhuǎn)錄因子靶基因集進(jìn)行了GSEA。在活性只有一個方向變化的因子中，GATA2是DTP和DTPL細(xì)胞中上調(diào)最多的轉(zhuǎn)錄因子(圖4D,E)。據(jù)報道，GATA2至少部分通過激活NF-кB來促進(jìn)肺癌的生存。MYC是DTP和DTPL細(xì)胞中最高下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子，E2F在這兩個群體中也顯著下調(diào)(圖4D,E)。在DTP/DTPL細(xì)胞中，NFE2L2/NRF2活性被預(yù)測上調(diào)，從而促進(jìn)了周期PC9 DTPs的產(chǎn)生和EGFR TKI耐藥性的產(chǎn)生。NRF2的結(jié)果得到了證實，即A549細(xì)胞中由直接NRF2靶標(biāo)組成的signature在DTP中最高，在DTPL細(xì)胞中居中，在BL細(xì)胞中最低(圖4F)。
為了研究不同EGFR突變的肺癌PDX之間治療初期腫瘤細(xì)胞群體和DTP異質(zhì)性的潛在相似性，在另一個TKI治療的PDX模型上進(jìn)行了scRNA-seq分析。PHLC164具有EGFR外顯子19缺失和T790M突變，并與奧西美替尼治療50天以產(chǎn)生DTP(圖5A)。對BL和DTP細(xì)胞的scRNA-seq聯(lián)合分析表明，49%的DTP位于第3簇，包含少量BL細(xì)胞亞(圖5B)，代表DTPL細(xì)胞。PHLC164 DTPs和DTPL細(xì)胞中至少有24%和18%的DEG分別與PHLC137中相應(yīng)的群體共享(圖5C)。PHLC164 DTP DEGs也富集了與PHLC137 DTP DEGs相似的上調(diào)和下調(diào)通路(圖5D)。最后，在患者樣本中鑒定的PHLC164 DTPs具有殘留疾病(RD)和肺泡特征的表達(dá)升高，并且可以確認(rèn)PHLC164 DTPL細(xì)胞具有肺泡特征的中間表達(dá)(圖5E)。因此，用不同的TKIs治療的不同EGFR突變肺癌PDX模型在已有的DTPL細(xì)胞和DTPs中顯示出一些相似性。
DTP腫瘤間質(zhì)獨特的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)表型。
CAFs是一種異質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞，可促進(jìn)癌癥的腫瘤進(jìn)展，并與TKI治療后復(fù)發(fā)有關(guān)。TKI治療如何改變treatment-na?ve與DTP癌細(xì)胞中的CAF尚不清楚。使用scRNA-seq數(shù)據(jù)比較PHLC137模型中BL和DTP腫瘤中的CAFs(圖6A)。在兩種腫瘤狀態(tài)下，大約3900個小鼠細(xì)胞被標(biāo)記為成纖維細(xì)胞(圖6B)。CAFs聚集成4個亞群(圖6C)，簇4和5在狀態(tài)之間的共享比例相似。簇2在BL中CAF亞群最多，但在DTP腫瘤中幾乎完全消失。相反，簇0在BL狀態(tài)下是次要亞群體，在DTP狀態(tài)下是優(yōu)勢亞群體。
簇2為肌成纖維細(xì)胞“myCAFs”，是treatment-na?ve癌癥中描述最一致的CAF群體，由TGF-β信號通路誘導(dǎo)。簇4的特征描述了myCAF在傷口愈合和T細(xì)胞滲透中的活躍作用。簇5是iCAF，由于其分泌的細(xì)胞因子，具有更多的促炎表型。
通過偽時間分析(圖6E)，簇2、簇5和簇0 CAF在軌跡結(jié)束時被視為不同的位置，這表明它們代表明確的穩(wěn)定狀態(tài)。簇2和簇5中的狀態(tài)可以與這些簇的top signature所描述的CAF相關(guān)。簇4可能是不同的中間激活狀態(tài)。
對分泌信號因子的分析顯示，每個CAF簇都表達(dá)促生長和免疫調(diào)節(jié)因子，簇4、簇5和簇0也分泌促血管生成信號，簇2產(chǎn)生TGF-β配體(圖6F)。雖然Fgf7在簇0 CAF中上調(diào)，但在DTP癌細(xì)胞中ERK活性并沒有增加。免疫調(diào)節(jié)因子是cluster特有的，突出了每一種CAF亞型可能發(fā)揮其獨特的免疫調(diào)節(jié)形式。
IL6-JAK-STAT3信號在0簇CAFs中活躍，DTP基質(zhì)細(xì)胞中約40%的磷酸化-STAT3，比BL基質(zhì)細(xì)胞增加了兩倍。同樣，DTP癌細(xì)胞中的STAT3磷酸化相對于BL癌細(xì)胞增加(圖7A,B)。IL6已被證明可以促進(jìn)EGFR突變肺癌細(xì)胞系對TKI治療的生存。總之，這些研究結(jié)果表明，由簇0 CAFs分泌的Il6可以激活PHLC137 DTPs中的STAT3，促進(jìn)其在體內(nèi)的生存。
TKI治療期間，簇2和簇0 CAF之間的顯著轉(zhuǎn)變表明這些群體相互轉(zhuǎn)換。首先從PHLC137 BL和DTP腫瘤中提取CAF培養(yǎng)物。發(fā)現(xiàn)與這些CAF的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄圖譜一致。TGF-β刺激BL CAF進(jìn)一步增加了簇2 CAF標(biāo)記的表達(dá)(圖7B)，與簇2的表型類似于TGF-β調(diào)節(jié)的MyCAF。相反，用IL1α刺激BL CAF，誘導(dǎo)簇0標(biāo)記的表達(dá)(圖7B)。這些發(fā)現(xiàn)與用人類CAF進(jìn)行的類似實驗平行。然而，總體而言，數(shù)據(jù)支持由TGF-β和NF-кB激活劑調(diào)節(jié)的CAF可塑性和相互轉(zhuǎn)化機制。最后，測試了在EGFR突變的肺癌細(xì)胞和CAF的共培養(yǎng)中，厄洛替尼治療是否可以將簇2 CAF轉(zhuǎn)化為簇0表型。在厄洛替尼治療12天后，簇0表型更強大的標(biāo)記之一IL6的表達(dá)增加了12倍，而簇2標(biāo)記Lrrc15的表達(dá)下調(diào)(圖7C)。因此，TKI治療前和治療后的主要CAF群體可能反映了一種單一類型的CAF群體，其表型受TGF-β和NF-кB激活劑的調(diào)節(jié)，以及它們的調(diào)節(jié)受TKI的存在或缺失(圖7D)。
DTP腫瘤保持了未經(jīng)治療的(BL)腫瘤的基因組克隆結(jié)構(gòu)，但表現(xiàn)出減少的增殖。scRNA-seq鑒定了一種罕見的BL細(xì)胞亞群(DTP樣細(xì)胞，DTPL)，與DTP細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上相似，并且在DTP細(xì)胞中上調(diào)的通路具有中等活性。此外，腫瘤中TGF-β激活的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)被富含IL6的CAF群體所取代。體外實驗表明，這些群體的相互轉(zhuǎn)換依賴于TGF-β和NF-кB信號的水平，后者受TKI的存在調(diào)節(jié)。DTP顯示有NF-кB和STAT3信號增強的跡象，這可能促進(jìn)了它們的生存。
