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在過去的十年中，隨著各種免疫檢查點抑制劑和嵌合抗原受體T細(xì)胞治療的開發(fā)和應(yīng)用，免疫療法領(lǐng)域已經(jīng)徹底改變了許多癌癥的治療。其中，由于T細(xì)胞在癌癥治療中占據(jù)著重要的地位，能夠觸發(fā)針對新抗原的新T細(xì)胞反應(yīng)的個性化疫苗，將成為另一種有希望的癌癥免疫治療方法。因此，今天小編帶大家閱讀一篇2022年4月3日發(fā)表在nature cancer上的一篇文章，看看作者是如何探究T細(xì)胞在聯(lián)合治療中的作用。
Concurrent delivery of immune checkpoint blockade modulates T cell dynamics to enhance neoantigen vaccine-generated antitumor immunity
免疫檢查點阻斷劑的協(xié)同傳遞可調(diào)節(jié)T細(xì)胞動態(tài)以增強(qiáng)新抗原疫苗產(chǎn)生的抗腫瘤免疫力
文章摘要
新抗原疫苗旨在誘導(dǎo)腫瘤特異T細(xì)胞反應(yīng)，并且在早期臨床試驗中取得了良好的抗腫瘤效果。然而，關(guān)于這種治療的反應(yīng)或抵抗的基本機(jī)制尚不清楚。作者觀察到新抗原疫苗產(chǎn)生的T細(xì)胞可以與免疫檢查點阻斷協(xié)同作用，從而有效控制腫瘤。具體來說，作者對超過10萬個T細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞測序，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療能誘導(dǎo)抗原特異性CD8 T細(xì)胞群，具有活躍的趨化因子信號，較低的共抑制受體表達(dá)和較高的細(xì)胞毒性。此外，聯(lián)合治療需要在引流淋巴結(jié)中產(chǎn)生新抗原特異性T細(xì)胞。這一獨特群體的特征基因與T細(xì)胞的克隆頻率和人類更好的生存有關(guān)。該研究描述了新抗原疫苗和免疫檢查點阻斷治療期間腫瘤浸潤T細(xì)胞的動態(tài)，并識別新抗原反應(yīng)性T細(xì)胞特征，以利于未來治療策略的制定。
結(jié)果
新抗原疫苗與ICB協(xié)同作用，誘發(fā)持久的抗腫瘤免疫反應(yīng)
為了研究新抗原疫苗誘導(dǎo)的體內(nèi)T細(xì)胞反應(yīng)和抗腫瘤作用，首先對小鼠結(jié)腸直腸腫瘤模型MC38進(jìn)行了新抗原疫苗治療。根據(jù)最近新抗原疫苗研究的劑量和時間表，選擇了9聚體突變的ADP依賴性葡糖激酶肽 (ASMTNMELM) 作為新抗原以及兩種Toll樣受體(TLR) 受體激動劑作為佐劑。兩劑新抗原ADPGK疫苗顯示出適度的抗腫瘤作用，腫瘤生長延遲（圖1a）。然而沒有觀察到腫瘤消退，表明單獨使用新抗原疫苗的抗腫瘤作用有限。接下來檢查了引流淋巴結(jié)（DLN） 中新抗原特異性T細(xì)胞的水平。無論小鼠是否患有腫瘤，與非DLNs相比，疫苗接種有效地誘導(dǎo)了DLNs中的tetramer+細(xì)胞（圖1b）。然而，與淋巴結(jié)中的T細(xì)胞相比，腫瘤組織中的新抗原ADPGK特異性T細(xì)胞在接種疫苗后略有增加，并表現(xiàn)出耗竭型，PD-1和TIM-3表達(dá)升高（圖1c）。腫瘤組織中的ADPGK特異性T細(xì)胞與DLNs相比TOX表達(dá)水平更高（圖 1d）。基于這些結(jié)果，作者假設(shè)免疫抑制性TME通過控制T細(xì)胞功能狀態(tài)來限制新抗原疫苗接種的功效。為了檢驗這一假設(shè)，首先分析了來自MC38模型TIL的PD-L1表達(dá)的scRNA-seq數(shù)據(jù)。腫瘤中的髓樣細(xì)胞群，尤其是中性粒細(xì)胞和常規(guī)樹突狀細(xì)胞的PD-L1表達(dá)水平高于淋巴結(jié)中的相應(yīng)細(xì)胞群（圖 1e）。單獨用抗PD-L1或新抗原疫苗治療攜帶MC38的小鼠顯示部分反應(yīng)，而聯(lián)合治療導(dǎo)致腫瘤完全消退并顯著提高存活率（圖 1f-h），這證實了PD-1/PD-L1信號對新抗原疫苗接種的抑制作用。該小鼠模型和作者的治療方案重現(xiàn)了人體臨床試驗中的觀察結(jié)果，適合研究聯(lián)合治療的機(jī)制。對從未治療小鼠(第10天和20天)的腫瘤、DLN和脾組織中收集的T細(xì)胞(作為對照)和從不同療法下的小鼠(第20天)中收集的T細(xì)胞進(jìn)行了具有靶向TCR捕獲的scRNA-seq(scTCR-seq ),以研究T細(xì)胞群體的動態(tài)變化。同時，新抗原ADPGK特異性T細(xì)胞也通過四聚體分選進(jìn)行富集，以進(jìn)行scTCR-seq，其用于下游分析，以鑒定新抗原反應(yīng)性T細(xì)胞簇(圖1i)。
T細(xì)胞群的高分辨率表征
在這章中作者對細(xì)胞分亞群。本研究中獲得了100,899個T細(xì)胞的scRNA-seq譜，其中包含95,138對TCR序列。質(zhì)量控制后，保留93,399個T細(xì)胞用于下游分析。根據(jù)差異表達(dá)基因和組織分布模式區(qū)分23個簇，推斷它們的潛在功能（圖2a）。在不同治療組的淋巴和腫瘤組織之間，這些簇的分布存在高度異質(zhì)性。特別是，CD8-01-Sell-P.na和CD4-01-Tcf7-P.na等在淋巴組織中富集，腫瘤浸潤性T細(xì)胞中主要富集CD4和CD8簇（圖2b-d）。作者發(fā)現(xiàn)DLNs中T細(xì)胞的組成相對穩(wěn)定。而腫瘤T細(xì)胞簇在不同療法中表現(xiàn)出更高的異質(zhì)性。接下來定義了腫瘤中CD4和CD8 T細(xì)胞的動態(tài)變化。CD4 T細(xì)胞表達(dá)共刺激分子（圖2b、c）。除了典型的CD8+ T細(xì)胞簇，作者還鑒定了兩個與TME中其他明確定義的CD8 T細(xì)胞群不共享相同signature基因的獨特CD8簇。一種是CD8-09 簇，類似于上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞 (IEL)。另一種（CD8-07）僅見ICB治療組（圖2d），具有與CD8-08相似的耗竭表型，但表達(dá)更高水平的顆粒酶家族基因，將此簇定義為ICB治療響應(yīng)者。在此章節(jié)中發(fā)現(xiàn)，ICB和新抗原疫苗的組合通過誘導(dǎo)不同的T細(xì)胞簇來重塑TME。
聯(lián)合治療使TME恢復(fù)活力，有利于Teff細(xì)胞功能
為了研究腫瘤進(jìn)展過程中T細(xì)胞狀態(tài)的動態(tài)，比較了早期和晚期的T細(xì)胞組分，發(fā)現(xiàn)TME在早期由新浸潤的T細(xì)胞組成，在晚期具有更強(qiáng)的免疫抑制性。新抗原疫苗單一療法降低了功能障礙CD8 T細(xì)胞的百分比，同時增加CD8 Teff細(xì)胞。然而，治療期間Treg細(xì)胞的比例也增加，這可能解釋了為什么新抗原疫苗治療僅誘導(dǎo)了有限的抗腫瘤效果。與單獨使用疫苗相比，聯(lián)合使用ICB疫苗可顯著增加Teff細(xì)胞，并減少功能失調(diào)的CD8 T細(xì)胞和Treg細(xì)胞。為了證實scRNA-seq定義的這些觀察結(jié)果，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在蛋白質(zhì)水平對代表性標(biāo)記進(jìn)行染色。早期腫瘤含有許多幼稚表型的T細(xì)胞(圖2e，h)。作者還證實，用聯(lián)合療法治療的腫瘤具有較低水平的Treg細(xì)胞（圖2i）和衰竭表型的CD8 T細(xì)胞（圖2f）。聯(lián)合治療也顯著降低了TOX+ CD8 T細(xì)胞的百分比（圖2g）。同時，聯(lián)合治療組中CD4-TH1細(xì)胞增加（圖 2j）?；谶@些結(jié)果，作者得出結(jié)論，聯(lián)合治療產(chǎn)生了可能有利于Teff細(xì)胞功能的TME。
克隆T細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換的譜系跟蹤
本研究獲得了12,053個克隆T細(xì)胞（圖3a），大多數(shù)克隆T細(xì)胞分布在富含腫瘤的簇中，對不同治療的反應(yīng)有顯著變化（圖 3b，c）。然后使用克隆評分（CS）來量化克隆擴(kuò)增的程度。在所有CD8+ T細(xì)胞簇中，CD8-08是 20天組中的主要克隆擴(kuò)增簇（圖 3d）。 在 CD4+ T細(xì)胞中，Treg細(xì)胞和TH1樣T細(xì)胞（CD4-06）在大多數(shù)腫瘤樣本中表現(xiàn)出最高的克隆擴(kuò)增（圖 3e）。然而，在聯(lián)合處理后，Treg細(xì)胞的克隆擴(kuò)增能力被顯著抑制。此外，聯(lián)合治療也促進(jìn)了CD4-06的克隆擴(kuò)增。這些結(jié)果表明，聯(lián)合治療可以通過調(diào)節(jié) T 細(xì)胞的擴(kuò)增能力來重塑 TME。接下來，研究了T細(xì)胞簇的克隆共享，以跟蹤其潛在的遷移和狀態(tài)過渡，克隆共享發(fā)生在不同的腫瘤內(nèi)CD8+簇之間（圖3F），表明TME中的CD8+ T細(xì)胞通常經(jīng)歷廣泛的狀態(tài)過渡。研究T細(xì)胞簇的克隆共享，以跟蹤其潛在的遷移和狀態(tài)轉(zhuǎn)換，作者發(fā)現(xiàn)克隆共享發(fā)生在不同的腫瘤內(nèi)CD8+簇之間(圖3f)，表明TME淋巴瘤中的CD8+ T細(xì)胞通常經(jīng)歷廣泛的狀態(tài)轉(zhuǎn)換。在新抗原疫苗組中，一致性克隆最高(圖3g)，即疫苗治療可能促進(jìn)T細(xì)胞從淋巴組織中募集。接下來作者定義了遷移分?jǐn)?shù)，即兩個簇之間共享克隆的加權(quán)熵，以表征淋巴簇和腫瘤內(nèi)簇之間的遷移。在所有瘤內(nèi)CD8+簇中，大多數(shù)治療組中CD8-05向CD8-03的遷移評分最高(圖3h)，表明隨后在TME發(fā)生了CD8 Teff細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。接下來進(jìn)行偽時序分析，發(fā)現(xiàn)軌跡起源于狀態(tài)1，結(jié)束于狀態(tài)4（圖3i）。沿著軌跡的T細(xì)胞表現(xiàn)出衰竭和細(xì)胞毒性評分增加，干性評分降低（圖3j，k）。
新抗原特異性T細(xì)胞富含CD8 Teff細(xì)胞簇
使用iSMART算法，根據(jù)TCR的相似性對TCR進(jìn)行聚類鑒定了1,415個 TCR組。然后，將每組中T細(xì)胞的數(shù)量與其在未處理小鼠淋巴組織中的數(shù)量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)20個TCR組顯著富集。將這些TCR定義為高置信度的新抗原ADPGK特異性TCR（圖 4a ）。使用這些TCR跟蹤scRNA-seq數(shù)據(jù)中的新抗原特異性T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它們在聯(lián)合治療組中富集（圖 4b）。具體而言，CD8-05 和CD8-04含有比任何其他腫瘤內(nèi)CD8簇更高多的新抗原特異性 T 細(xì)胞（圖 4c），這是由多個TCR組驅(qū)動的（圖 4d）。進(jìn)一步研究了CD8-05 T細(xì)胞的DEGs，以鑒定該T細(xì)胞亞群的特征基因。細(xì)胞毒性效應(yīng)分子，在該簇中要高得多。同時，趨化因子及趨化因子受體也上調(diào)，說明這些細(xì)胞有遷移能力(圖4e)。此外，這些細(xì)胞還激活CD69的表達(dá)，顯著降低的共抑制分子(圖4f)。富集分析結(jié)果進(jìn)一步證實了上一步的結(jié)論(圖4g)。
聯(lián)合治療在體內(nèi)誘導(dǎo)新抗原特異性 Teff 細(xì)胞
接下來進(jìn)行了實驗以驗證體內(nèi)Teff細(xì)胞的表型。首先在不同的免疫療法后對TIL 進(jìn)行四聚體染色。與單一療法相比，聯(lián)合治療顯著增加了tetramer+ 細(xì)胞的頻率（圖 5a、b ）。與單獨治療相比，聯(lián)合治療顯著降低了LAG3+ CD8 T細(xì)胞的百分比，TIL中CXCR3的表達(dá)上調(diào)（圖 5c、d ）。這與我們在scRNA-seq中的發(fā)現(xiàn)一致，這表明CD8-05中的大多數(shù)T細(xì)胞是Lag3- 并且一些細(xì)胞Cxcr3的表達(dá)上調(diào)（圖 4f）。
來自DLN的新抗原特異性T細(xì)胞引發(fā)抗腫瘤效應(yīng)
作者使用FTY720，在聯(lián)合治療之前和期間阻止T細(xì)胞從淋巴結(jié)流出（圖 5e）。FTY720完全消除了抗腫瘤作用，表明來自DLN的新浸潤T細(xì)胞是必不可少的（圖5f）。同時，F(xiàn)TY720治療顯著降低了產(chǎn)生IFN-γ的CD8 T細(xì)胞（圖5g）和tetramer+ T細(xì)胞（圖5h）的百分比，進(jìn)一步表明在腫瘤中淋巴組織是新抗原特異性T細(xì)胞的主要來源。給na?ve小鼠接種新抗原疫苗，并在6天后收集DLN中的淋巴細(xì)胞。然后將細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到攜帶MC38的 Rag1-/- 小鼠，然后進(jìn)行抗PD-L1治療（圖5i）。 DLN中的新抗原疫苗刺激的淋巴細(xì)胞與抗PD-L1協(xié)同控制腫瘤（圖 5j）。此外，在疫苗引發(fā)的淋巴細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移后，抗PD-L1治療顯著增加了脾臟和腫瘤中抗原特異性T細(xì)胞的百分比（圖5k，1）。在聯(lián)合治療后，特異于另一個MC38表位的T細(xì)胞百分比也顯著增加，表明T細(xì)胞反應(yīng)可能在最初的腫瘤抗原啟動后發(fā)生表位擴(kuò)散（圖 5m-o）。基于這些結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗PD-L1通過再生來自DLN的新抗原特異性T細(xì)胞擴(kuò)大了新抗原疫苗的治療效果。
新抗原特異性 T 細(xì)胞基因特征與人類癌癥的更好臨床結(jié)果相關(guān)
為了探索MC38的新抗原特異性T細(xì)胞基因特征在人類癌癥中是否具有可重復(fù)性，首先定義了新抗原特異性T細(xì)胞的基因特征。選擇了在人類基因組中也有的CD8-05的DEGs，并通過使用每個DEG作為CD8-05與所有其他CD8 T細(xì)胞的預(yù)測指標(biāo)，進(jìn)行監(jiān)督特征選擇。前5個marker的平均表達(dá)量達(dá)到了0.92的AUC。因此，將這五個marker的平均表達(dá)量定義為癌癥抗原特異性T細(xì)胞（CAST）得分，它可以作為新抗原特異性T細(xì)胞部分的替代物（圖6a）。接下來估計了TCGA數(shù)據(jù)庫中人類癌癥的CAST評分，并選擇了23種癌癥類型和100多名患者來研究其在預(yù)后中的作用。由于CD8 T細(xì)胞浸潤是多種TCGA癌癥患者預(yù)后的預(yù)測因素，針對CD8 T細(xì)胞水平分層進(jìn)行Cox比例風(fēng)險回歸分析，并估計了單因素Cox模型中CAST評分的風(fēng)險比(HR)（圖6b）。在黑色素瘤、頭頸部、宮頸癌和胰腺癌中，CAST評分評分高，CD8 T細(xì)胞浸潤高的患者的總生存率更好（圖6c-j）。因此，小鼠新抗原特異性T細(xì)胞的鑒別性標(biāo)記可以預(yù)測CD8 T細(xì)胞高浸潤的患者生存率。由于大多數(shù)TCGA樣本沒有經(jīng)過免疫治療，作者分析了抗PD-1治療前后的晚期基底細(xì)胞癌（BCC）患者的公共數(shù)據(jù)集。事實上，CAST評分與CD8+T細(xì)胞克隆頻率有極大的相關(guān)性（圖6k）。此外，具有高CAST分?jǐn)?shù)的大克隆在表型上是相似的（圖6l）。最后，抗PD-1治療增加了四個病人中三個的CAST分?jǐn)?shù)（圖6m），從而證實了ICB在TME中擴(kuò)大抗原特異性T細(xì)胞的作用。
總結(jié)
作者從新抗原疫苗與ICB的協(xié)同作用出發(fā)，分析T細(xì)胞的scRNA-seq，解析內(nèi)在機(jī)制。這個工作補(bǔ)充了當(dāng)前對新抗原疫苗的人體臨床研究，并解決了有關(guān)其抗腫瘤免疫反應(yīng)的一些基本問題。近些年來單細(xì)胞領(lǐng)域快速發(fā)展，是大家研究的熱點，生信人平臺也持續(xù)關(guān)注著這個領(lǐng)域，感興趣的小伙伴趕緊上車吧！
參考文獻(xiàn)：
Advances in the development of personalized neoantigen-based therapeutic cancer vaccines
