掃碼聯(lián)系客服
大家好呀，今天分享的文章題為在單細(xì)胞水平表征腫瘤微環(huán)境揭示骨肉瘤中一種新的免疫逃逸機(jī)制，文章內(nèi)容扎實(shí)詳盡，于今年一月發(fā)表在《Bone Research》（IF = 13.362）上，讓我們來一起學(xué)習(xí)一下吧！
一、摘要
免疫微環(huán)境廣泛參與骨肉瘤（Osteosarcoma（OS））的發(fā)生和發(fā)展。然而，OS中免疫細(xì)胞的景觀和動(dòng)態(tài)特征還不清楚。作者通過分析單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)，繪制了OS免疫微環(huán)境的圖譜。結(jié)果表明，一群調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞（DC）可能通過募集調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來塑造OS免疫抑制微環(huán)境。并且主要組織相容性復(fù)合體I類（MHC-I）分子在癌細(xì)胞中下調(diào)。研究結(jié)果表明OS中腫瘤免疫原性降低，這可能是腫瘤免疫逃逸的潛在機(jī)制。值得注意的是，CD24被確定為一種新的 ” don’t eat me ” 信號(hào)，有助于OS細(xì)胞的免疫逃避?？傊覀兊难芯拷Y(jié)果提供了對(duì)OS免疫狀況的見解，提示骨髓靶向免疫治療可能是治療OS的一種有前途的方法。
二、結(jié)果
1、使用單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析骨肉瘤腫瘤微環(huán)境
在已發(fā)表的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集（GSE152048）中，有7個(gè)原發(fā)性腫瘤病變，2個(gè)復(fù)發(fā)性腫瘤病變和2個(gè)肺轉(zhuǎn)移灶。本文納入了scRNA-seq數(shù)據(jù)，并與來自85例患者的腫瘤組織的大量RNA-seq數(shù)據(jù)相結(jié)合，經(jīng)過質(zhì)量控制后（以及消除患者之間的批次效應(yīng)），鑒定出了8個(gè)細(xì)胞簇：髓系細(xì)胞（LYZ+）、淋巴細(xì)胞（CD3D+）、破骨細(xì)胞（ACP5+）、內(nèi)皮細(xì)胞（CLDN5+）、血管周圍樣細(xì)胞（PVL）（RGS5+TAGLNhigh）、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）（TAGLNlowACTA2+）和增殖細(xì)胞（MKI67+）。在髓系細(xì)胞群中，注釋了巨噬細(xì)胞（APOE+CD68+）、單核細(xì)胞（S100A8+S100A9+）和樹突狀細(xì)胞（HLA-DQA1highCD14-）。對(duì)于淋巴細(xì)胞，我們對(duì)CD4 T細(xì)胞（IL7R+）、CD8 T細(xì)胞（CD8A+）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）（TNFRSF4+）、自然殺傷（NK）細(xì)胞（GNLY+GZMB+）和B細(xì)胞（CD79A+JCHAIN+）進(jìn)行了分類。此外， PDGFRA+CXCL12+ CAFs被注釋為炎癥性CAFs（iCAFs），而肌成纖維細(xì)胞樣CAFs的特征是ACTA2高表達(dá)，PDGFRA-表達(dá)（圖1）。
2、腫瘤相關(guān)的樹突狀細(xì)胞通過招募調(diào)節(jié)性T細(xì)胞促進(jìn)腫瘤免疫耐受
在OS中有三個(gè)樹突狀細(xì)胞（DC）亞群，包括傳統(tǒng)的1類樹突狀細(xì)胞（cDC1s）（XCR1+CLEC9A+）和傳統(tǒng)的2類樹突狀細(xì)胞（cDC2s）（CD1C+CLEC10A+）。此外，在OS中發(fā)現(xiàn)了一簇CD83+CCR7+LAMP3+樹突狀細(xì)胞，可稱為成熟調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞（mregDc）。為了研究這些mregDCs是否具有腫瘤特異性，作者通過Harmony軟件包從正常外周血單核細(xì)胞（PBMC）（GSE94820）和兩個(gè)OS隊(duì)列（GSE152048和GSE162454）中提取DC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)mregDCs優(yōu)先存在于兩個(gè)獨(dú)立的OS隊(duì)列中，但在正常PBMCs中幾乎不存在，表明mregDCs可能是腫瘤相關(guān)的DC群體。此外，OS骨髓中CD83+CCR7+LAMP3+樹突狀細(xì)胞的數(shù)量高于正常骨髓。綜上所述，在OS中存在一組腫瘤特異性樹突狀細(xì)胞（圖2）。
在對(duì)DC進(jìn)行重新聚類后，使用來自Seurat v3包的功能來計(jì)算從PBMC到OS數(shù)據(jù)集中識(shí)別的不同子集的相似性。結(jié)果顯示mregDC和cDC1亞群之間具有相似性。使用Monocle2對(duì)DC群體和mregDCs進(jìn)行擬時(shí)序分析，發(fā)現(xiàn)OS中的mregDCs可能起源于cDC1，這與之前研究結(jié)果一致。此外，輔抑制劑CD274、LAG3、LGALS9、SIRPA、TIGIT和PDCD1LG2均沿分化軌跡上調(diào)。與cDC1s和cDC2s相比，mregDCs表現(xiàn)出”激活”表型，具有更高的遷移能力和免疫調(diào)節(jié)能力，表明該DC亞群是成熟的調(diào)節(jié)DC。更重要的是，mregDCs特異性表達(dá)CCR7、CCL17、CCL19和CCL22，它們可以招募多種浸潤(rùn)性T細(xì)胞。由于目前只包括11例患者，通過計(jì)算mregDC和數(shù)據(jù)庫中T細(xì)胞之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)mregDCs與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）之間有很強(qiáng)的相關(guān)性，同時(shí)，作者對(duì)腫瘤切片染色發(fā)現(xiàn)mregDCs和Tregs物理位置也是相近的。為了研究DC亞群的臨床作用，通過CIBERSORTx估算OS細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)mregDC評(píng)分與較差的總生存率相關(guān)，Tregs的積累與總體生存率負(fù)相關(guān)。mregDC與Tregs之間呈正相關(guān)，表明mregDCs可能通過在OS 腫瘤免疫微環(huán)境（TME）中招募Tregs來促進(jìn)腫瘤免疫耐受（圖3）。
3、癌細(xì)胞免疫原性的異質(zhì)性
拷貝數(shù)變異（CNVs）是一種有效的策略來識(shí)別更具侵襲性的癌細(xì)胞克隆。研究發(fā)現(xiàn)，在成軟骨細(xì)胞OS病變中積累了更多的典型的CNVs，然而，高CNV是否會(huì)導(dǎo)致免疫逃逸尚不清楚。本文檢測(cè)了CNV與OS中免疫應(yīng)答之間的關(guān)系。通過整合基質(zhì)細(xì)胞，估計(jì)每個(gè)細(xì)胞的CNV。結(jié)果顯示，癌細(xì)胞比成纖維細(xì)胞積累了更多的CNVs。有趣的是，在基質(zhì)細(xì)胞中觀察到一簇低CNV的癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄因子和基序分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子（TF）基序包括CEBPB（+）、FOSB（+）、FOSB（+）、SAP30（+）和ATF4（+）在高CNV的癌細(xì)胞中顯著上調(diào)，而IRF3（+）、ETV7（+）、STAT1（+）和IRF7（+）下調(diào)，揭示了一種在OS細(xì)胞中由TFs驅(qū)動(dòng)的新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，MSigDB標(biāo)志基因集的基因本體論（GO）富集分析和基因集變異分析（GSVA）均顯示，IFN-γ反應(yīng)在低CNV的癌細(xì)胞中富集。由于MHC-I的轉(zhuǎn)錄下調(diào)是損害IFN-γ信號(hào)通路抗腫瘤作用的最重要因素之一，隨后作者在mRNA水平上檢測(cè)了MHC-I分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CNV水平較高的癌細(xì)胞表現(xiàn)出較低水平的MHC-I基因（HLA-A、HLA-B和HLA-E）和B2M基因，這表明這些癌細(xì)胞的免疫原性較低。為了進(jìn)一步研究MHC-I的下調(diào)是否在OS中廣泛存在，通過免疫組化（immunohistochemistry）染色評(píng)估了OS患者切片中MHC-I和B2M的表達(dá)。結(jié)果顯示，具有高級(jí)別的OS下調(diào)了MHC-I和B2M的表達(dá)。基于這些發(fā)現(xiàn)，在高級(jí)別OS中，干擾素信號(hào)通路和MHCI類分子的下調(diào)可能導(dǎo)致免疫逃逸（圖4）。
4、CD24信號(hào)通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的OS免疫應(yīng)答
在多種類型的癌癥中，腫瘤微環(huán)境（TME）常常使巨噬細(xì)胞分化為促腫瘤表型，OS中大多數(shù)巨噬細(xì)胞為M2表型（表現(xiàn)出抗炎和促腫瘤作用）。然而，驅(qū)動(dòng)免疫耐受的潛在機(jī)制尚未完全了解。癌細(xì)胞通過高表達(dá)抗吞噬表面蛋白，包括CD47和程序性細(xì)胞死亡配體1（由CD274編碼）來逃避免疫細(xì)胞的清除。CD24是一種新的 ” don’t eat me ” 信號(hào)，可以抑制Toll樣受體介導(dǎo)的炎癥和巨噬細(xì)胞的吞噬。CD24和CD47的表達(dá)強(qiáng)于CD274，表明在OS中是巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫逃逸而非T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫逃逸。并發(fā)現(xiàn)CD47在幾乎所有細(xì)胞類型中都高表達(dá)，而CD24在OS細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)。熒光原位雜交（FISH）顯示，CD24在同一患者的OS組織中的mRNA表達(dá)高于正常骨髓。此外，發(fā)現(xiàn)高CNV癌細(xì)胞比低CNV癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)更高的CD24。IHC染色也顯示CD24在高級(jí)別OS中有更強(qiáng)的表達(dá)。這些結(jié)果共同說明了CD24是OS中潛在的免疫治療靶點(diǎn)。
為了研究CD24在OS中通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中的作用，用IL-4處理骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMDMs）生成M2巨噬細(xì)胞，并將這些吞噬細(xì)胞較少的巨噬細(xì)胞與GFP+ K7M2骨肉瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)36 h。通過活細(xì)胞顯微鏡觀察，在K7M2細(xì)胞系中對(duì)Cd24a的干擾增強(qiáng)了吞噬作用。類似地，基于熒光激活細(xì)胞分選（FACS）的測(cè)量結(jié)果顯示，與隨機(jī)siRNA相比，轉(zhuǎn)染Cd24a siRNA后的吞噬作用顯著增加。此外，與Cd24a敲低的癌細(xì)胞共培養(yǎng)的BMDMs具有更多的炎癥表型（圖5）。
為了研究下調(diào)CD24對(duì)吞噬作用的保護(hù)是否可以在體內(nèi)重現(xiàn)，作者用膽固醇修飾的Cd24a siRNA或隨機(jī)siRNA治療攜帶骨膜骨肉瘤的小鼠，移植后3周，通過CT掃描檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與隨機(jī)的siRNA組相比，Cd24a siRNA組的腫瘤致瘤性顯著降低。此外，IHC染色顯示，Cd24a siRNA組中MHC-II+細(xì)胞和浸潤(rùn)的CD4 T細(xì)胞顯著增加。FACS分析還表明Cd24a siRNA組吞噬作用和抗原呈遞作用的增強(qiáng)?？傊?，我們的研究結(jié)果顯示，OS細(xì)胞通過CD24信號(hào)通路逃避巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答（圖6）。
5、OS中的細(xì)胞互作
通過cellphonedb計(jì)算OS中細(xì)胞互作為OS TME提供新信息，CD24-SIGLEC10受體對(duì)在癌細(xì)胞和多個(gè)巨噬細(xì)胞亞群之間的富集揭示了CD24在OS中的免疫調(diào)節(jié)作用。此外，SPP1和ITGAV在SPP1+ TAMs和CAFs中的超高表達(dá)表明，SPP1+ TAMs可能通過CAFs中的對(duì)齊纖維連接蛋白來促進(jìn)癌細(xì)胞的定向遷移（圖7a）。接下來，通過對(duì)DC亞群的異質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行相互作用分析發(fā)現(xiàn)，cDC1具有通過CXCL10-CXCR3誘導(dǎo)多種T細(xì)胞浸潤(rùn)的強(qiáng)大能力，而mregDCs通過CD274-PDCD1和PVR-TIGHT與Tregs的相互作用表現(xiàn)出最高的免疫抑制能力，CAFs和SPP1+ TAMs通過ACKR3-CXCL12和CCL2/CXCL1-ACCR1軸與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用。ACKR家族在OS中的血管生成中起作用。其他配體受體對(duì)通過PGRMC2-CCL4L2參與癌細(xì)胞和SPP1+ TAMs之間的相互作用，以及通過CXCL12-CXCR4參與CAFs和TAMs之間的相互作用；不同病變例如OS樣本有原發(fā)性、復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性病變的成骨細(xì)胞骨肉瘤和成軟骨細(xì)胞骨肉瘤組成，由于細(xì)胞不處于同一個(gè)TME中，所以細(xì)胞不能相互作用；根據(jù)不同類型OS中細(xì)胞相互作用模式，髓系細(xì)胞通過與OS中的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的相互作用在TME中發(fā)揮作用。
三、小結(jié)
OS是一種常見的惡性的腫瘤，對(duì)于治療也是相當(dāng)困難，TME廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，本文通過數(shù)據(jù)庫中原有的單細(xì)胞數(shù)據(jù)對(duì)OS中細(xì)胞進(jìn)行劃分，并發(fā)現(xiàn)了確定了一種新的樹突狀細(xì)胞-成熟調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞，這種樹突狀細(xì)胞和Tregs高度相關(guān)；并且發(fā)現(xiàn)CD24是一種新的 ” don’t eat me ” 信號(hào)，可以抑制Toll樣受體介導(dǎo)的炎癥和巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞；通過細(xì)胞通訊分析發(fā)現(xiàn)不同病變類型OS的細(xì)胞不能進(jìn)行細(xì)胞互作，這也更加需要個(gè)體化治療。本篇文章的亮點(diǎn)在于利用已有的單細(xì)胞數(shù)據(jù)和RNA-seq數(shù)據(jù)從新的切入點(diǎn)分析OS的TME中細(xì)胞的互作，在發(fā)現(xiàn)成熟調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞時(shí)，作者比較了在正常PBMC和OS中成熟調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞存在情況，并利用RNA-seq數(shù)據(jù)計(jì)算成熟調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞和個(gè)體生存的關(guān)系是非常新穎的。
參考文獻(xiàn)：Liu W, Hu H, Shao Z, Lv X, Zhang Z, Deng X, Song Q, Han Y, Guo T, Xiong L, Wang B, Zhang Y. Characterizing the tumor microenvironment at the single-cell level reveals a novel immune evasion mechanism in osteosarcoma. Bone Res. 2023 Jan 3;11(1):4. doi: 10.1038/s41413-022-00237-6 . PMID: 36596773 ; PMCID: PMC9810605 .
