掃碼聯(lián)系客服
聚類分型的文章見的實在是太多了，大家好像都有一個疑問，我分了型能用到臨床嗎？實際遇到一個患者，我怎么知道他屬于哪一個類型？很遺憾告訴你，不能！除非手握大樣本量real world隊列。能夠?qū)嶋H應(yīng)用的常見類型就是模型構(gòu)建和maker篩選，所以這也是為什么很多文章在聚類分型之后構(gòu)建預(yù)后模型，就，它可以實際應(yīng)用啊。但是，今天小編要為聚類分型一“分”到底的文章正名，純生信不要實驗！
這是一篇七月底發(fā)表在Frontiers in Immunology（IF:8.786）雜志上的肝癌單細胞擬時序亞型的純生信文章，文章主要方法包括無監(jiān)督聚類、單因素及多因素cox分析、WGCNA及功能富集分析等經(jīng)典的生物信息方法。然而，不同于多數(shù)聚類分型的分析，文章在單細胞轉(zhuǎn)錄水平描述了免疫細胞的景觀，并確定了參與CD8+T細胞動態(tài)進化的軌跡基因，由此識別了肝細胞癌的三種亞型并進行刻畫。文章的研究角度很棒，感興趣的小伙伴不要錯過呀。
CD8+ T cell trajectory subtypes decode tumor heterogeneity and provide treatment recommendations for hepatocellular carcinoma
CD8+T細胞軌跡亞型可以解碼腫瘤的異質(zhì)性，并為肝細胞癌提供治療建議
背景
肝細胞癌（HCC）是一種常見的肝臟惡性腫瘤，在全球發(fā)病率方面排名第六，是全球死亡率的第二大原因。HCC主要是由一系列慢性肝病引起的，如肝硬化、HBV/HCV感染和脂肪肝疾病。目前，常用的治療方法包括根治性手術(shù)、經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞（TACE）、分子靶向藥物和免疫治療。然而，由于其較強的侵襲能力和高復(fù)發(fā)率，HCC患者的預(yù)后較差，5年生存率只有18%。此外，以往的研究表明，即使是相同臨床階段的患者，在治療效果和預(yù)后表現(xiàn)上也存在差異。這主要是因為廣泛使用的臨床分類系統(tǒng)側(cè)重于臨床病理特征，卻忽略了它們的分子特征。因此，增加對基因組異質(zhì)性的認識是非常必要的。尋找一種新的分子分類對患者的分層和臨床決策具有重要意義，從而進一步改善預(yù)后。
在此，作者根據(jù)單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)，描述了免疫細胞的景觀，并確定了參與CD8+T細胞動態(tài)進化的軌跡基因。隨后，基于TCGA-LIHC隊列識別了三個異質(zhì)性集群，并使用獨立的外部隊列進行驗證。三個集群具有明顯的預(yù)后、生物學(xué)特征、基因組變異和免疫浸潤微環(huán)境。此外，對使用不同臨床治療隊列的HCC患者提出了治療建議，包括免疫治療、TACE和索拉非尼治療。在這三個集群中也確定了潛在的治療藥物?？偟膩碚f，三個組的患者表現(xiàn)出不同的治療反應(yīng)，這為制定個體化治療策略提供了理論基礎(chǔ)。
本研究共收集并處理了15個獨立的公共數(shù)據(jù)集，包括單細胞RNA-seq隊列、高通量RNA-seq隊列、微陣列隊列和臨床治療隊列。使用單細胞RNA-seq隊列GSE140228展示了HCC的免疫景觀和動態(tài)。
結(jié)果
單細胞數(shù)據(jù)展示細胞亞型
為了描述CD45+免疫細胞的景觀和動態(tài)，作者進行單細胞轉(zhuǎn)錄組亞聚類分析，采用t-SNE的方法進行可視化。共有來自腫瘤和正常組織的3817個免疫細胞被分為17個簇（圖1A）。根據(jù)不同亞簇的基因特征，這些細胞主要由5個免疫細胞簇組成，包括B細胞、樹突狀細胞、單核細胞、自然殺傷細胞和T細胞（圖1B）。為了描述免疫細胞的來源，作者分別聚集了2212個腫瘤來源細胞和1605個非腫瘤來源細胞（圖1C）。單細胞富集分析顯示，所有的細胞都參與了免疫炎癥途徑，特別是樹突狀細胞、單核細胞和T細胞（圖1D）。作者進一步分析了百分比組成，并提取了每個免疫細胞簇的前5個標記物（圖1E，F(xiàn)）。值得關(guān)注的是，T細胞是腫瘤組織最普遍的細胞簇。眾所周知，T細胞具有抗腫瘤免疫能力和在腫瘤進展過程中直接殺死細胞的能力。因此，作者在單細胞水平上進一步探索和解碼T細胞。
圖1
在HCC進展過程中T細胞的動態(tài)變化
進一步揭示T細胞的進化。所有的T細胞再次聚集，并分為6個細胞亞群（圖2A）。先前的研究表明，CD3D和CD3E是CD4+和CD8+T細胞的共享基因標記物，因此，作者的研究提示，本研究中獲得的T細胞主要由CD4+和CD8+T細胞組成（圖2B，C）。特異性標記基因CD4在聚類1、2、3和5中表達，表明這些聚類代表CD4+T細胞（圖2D）。作者還注意到，簇0和簇4富集了CD8+T細胞標記物，如CD8A和CD8B，證實了CD8+T細胞的身份（圖2E，F(xiàn)）。進一步研究了CD8+T細胞中的免疫檢查點，其中大多數(shù)抑制性檢查點代表T細胞衰竭，如HAVCR2（TIM3）、LAG3、TIGIT、PDCD1（PD-1）和CTLA-4，這些檢查點在CD8+T簇2中顯著上調(diào)（圖2G）。擬時間和軌跡分析顯示，CD8+T細胞隨著腫瘤進展而趨于耗盡，這可能與不良預(yù)后有關(guān)（圖2H，I）。先前的一項研究也表明，T細胞排斥在TME中很常見，并與免疫特權(quán)相關(guān)。因此，這些沿著運動軌跡的基因可能在TME和HCC患者的臨床結(jié)局中發(fā)揮重要作用。
圖2
三個分子亞型的鑒定
基于軌跡基因識別與預(yù)后相關(guān)的候選基因?；谶@些基因的表達，作者利用NMF方法來識別異質(zhì)分子亞型（圖3A-C）。為便于臨床應(yīng)用，作者進一步探討了集群的預(yù)后意義。C2的總生存率（OS）和無復(fù)發(fā)生存率（RFS）較差，而C3預(yù)后較好（圖3D，E）。
圖3
亞型的特征基因和特定途徑
利用WGCNA軟件包對三個亞型的特征基因進行了鑒定。當β設(shè)置為6時，無標度R2為0.9，構(gòu)建了無標度網(wǎng)絡(luò)（圖4A）。此外，還展示了模塊-特征關(guān)系來測量模塊和三個聚類之間的相關(guān)性。綠松石色、藍色和紫色模塊分別與C1、C2和C3的相關(guān)性最強（圖4B）?；蝻@著性與模塊隸屬度之間的相關(guān)性值表明，基因模塊的構(gòu)建是穩(wěn)健的（圖4C-E）。為了探究三個亞型的特定生物學(xué)特征，進行GSEA分析（圖4F，G）?；诠δ芨患Y(jié)果，將C1描述為脂質(zhì)代謝的HCC，C2描述為細胞增殖的HCC，而C3被定義為免疫性炎癥性HCC。
圖4
亞型驗證
使用NTP方法，從不同平臺獲得多個隊列，測量和評估每個患者的預(yù)測置信度（圖5A，C）。KM分析顯示，C2仍然具有最不利的OS，而C3則具有最有利的OS，這與之前的結(jié)果一致（圖5B，D）。多因素Cox回歸分析顯示，C2是TCGA-LIHC、GSE14520和ICGC-LIRI隊列的獨立預(yù)后指標（圖5E-G）。此外，三個亞型在不同隊列中的比例顯示出很高的相似性（圖5H）。總的來說，這三個亞型的臨床結(jié)果存在異質(zhì)性，并且在HCC中具有可重復(fù)性和穩(wěn)健性。
圖5
基因組變異景觀
作者進一步描述了三個亞型之間的基因組變異景觀。如圖6A所示，顯示了前20個常突變基因（FMGs）的突變頻率、SNP、INDEL和TMB。為了增加對體細胞突變的理解，作者比較了3個亞型中20個FMGs的突變差異（圖6B）。引人注目的是，在所有分子簇中都顯示出三個普遍的FMGs，包括TP53、CTNNB1和TTN，這表明這些FMGs可能在腫瘤發(fā)生或腫瘤進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖6B）。在3個FMG中，CTNNB1和TTN在C1中突變明顯，而TP53突變在C2中占優(yōu)勢。C3的基因突變相對于其他基因突變最低，這意味著更好的臨床結(jié)果。作者進一步探索了CNV，并描述了三個亞型中常見的前10位AMP（擴增）和HOMDEL（純合刪除）的基因（圖6C）。有趣的是，與其他集群相比，C2的CNV值更高，而CSMD1基因的CNV缺失最為明顯（圖6C）?？偟膩碚f，C2患者表達了顯著的基因組變異，表明了高度的基因組不穩(wěn)定性。
圖6
免疫浸潤和免疫治療的評估
以上結(jié)果提示C3患者可能獲得更好的免疫治療效果。因此，作者描述了免疫細胞浸潤和免疫檢查點表達的景觀以分析潛在的機制。與其他亞型相比，C3表現(xiàn)出更多的免疫細胞浸潤豐度（圖7A），也表現(xiàn)出最高的免疫檢查點表達，如CD274（PD-L1）、CTLA-4和LAG3，提示C3可能對免疫檢查點抑制劑（ICI）治療更敏感（圖7B）。此外，C3中HLA分子的表達明顯升高，這證明C3患者具有較強的抗原呈遞能力（圖7C）?？偟膩碚f，精確免疫治療可能適用于C3型患者。
為了對免疫治療進一步探索，作者應(yīng)用TIS和Submap方法來評估不同亞型之間的臨床療效。與預(yù)期的一樣，C3的TIS評分最高，提示免疫激活和對ICIs的反應(yīng)升高（圖7D）?；赟ubmap算法，C3患者與對PD-L1抑制劑有反應(yīng)的患者的表達模式具有高度相似性，表明抗PD-L1治療更受益（圖7E）。隨后，提取C3的特征基因作為測量評分，命名為聚類相關(guān)免疫治療評分（CAIS）。值得注意的是，在所有隊列中，高得分組患者對免疫治療均表現(xiàn)出良好的反應(yīng)（圖7F，G）。綜上所述，上述數(shù)據(jù)表明CAIS是一個穩(wěn)健且有前途的免疫治療指標，建議C3型患者予以考慮使用免疫治療。
圖7
臨床治療和潛在治療藥物評估
根據(jù)更新的臨床指南，推薦對初發(fā)期患者采用TACE治療。與此相一致，以上結(jié)果也表明C1和C3患者對TACE治療有理想的療效（圖8A）。在三個組中進一步評估了索拉非尼的治療敏感性，證實C2患者可以獲得更多的臨床效益（圖8B）。在TCGA-LIHC隊列中，C2患者對nilotinib和bosutinib也表現(xiàn)出更優(yōu)越的反應(yīng)（圖8C，D）。此外，C1患者可能對較低的半抑制濃度值對阿西替尼更敏感（圖8E）。此外，展示了20種具有個性化治療潛力的化合物（圖8F），并描述了這些化合物的靶向途徑，可用于開發(fā)多種藥物（圖8G）。
圖8
小結(jié)
這篇文章揭示了HCC的腫瘤異質(zhì)性，并區(qū)分了HCC的三個亞型。在這三個亞型之間有不同的分子特征，它們有不同的臨床結(jié)果，生物學(xué)特征、基因組變異、免疫景觀和治療反應(yīng)。建議C1組患者接受TACE治療，鼓勵C2組患者接受TKI治療，而建議C3患者進行免疫治療。相比于其他聚焦基因水平的分型文章，該研究以單細胞數(shù)據(jù)切入，以T細胞的擬時序軌跡為關(guān)注點，區(qū)分腫瘤亞型，進行細致的解析刻畫，小編覺得是一個不錯的學(xué)習(xí)思路。
