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點找對，單細胞數(shù)據(jù)挖掘仍然輕松上12+
作為一門重要且獨立的自然學(xué)科，生物信息學(xué)在醫(yī)學(xué)科研工作上的正確使用方式，應(yīng)該是為研究者尋求無法通過經(jīng)典生物學(xué)實驗探索的研究方向，或者是將眾多的候選分子進行初步篩選，國外很多學(xué)者就是這樣使用了幾十年，而生物信息學(xué)在國內(nèi)的使用卻逐漸變了味道。當(dāng)然，小編不是說這樣不好，任何現(xiàn)象的產(chǎn)生在特定時空下都是合理的。只是覺得做任何事情都不要太過，過猶不及。如果太多的以生信為主的文章發(fā)表，會很大的影響潛心做實驗的學(xué)者的科研動力；同時，讓很多圈外人對生信產(chǎn)生誤解。
截止到目前，基于純生信或者生信為主的行文思路已經(jīng)被發(fā)表的差不多了，特別是近兩年國內(nèi)各大醫(yī)院發(fā)表了很多以生信為主的SCI論文，使得國外的編輯都不勝其煩。事實上，這種錯誤的導(dǎo)向?qū)ι胚@門學(xué)科的發(fā)展是十分不利的，因為目前的這種科研怪相使得很多科研學(xué)者對生信存在誤解。即便如此，我們偶爾還是能看到一些出彩的生信數(shù)據(jù)挖掘文章，今天Immugent通過今年發(fā)表在Journal of Pineal Research（IF=12.08）雜志上的一篇文章，篇名為：Single-cell transcriptomic analysis reveals circadian rhythm disruption associated with poor prognosis and drug-resistance in lung adenocarcinoma，來討論一下如何設(shè)計高分的數(shù)據(jù)挖掘行文思路。
圖1：
這篇文章也是國人做的，它立意新奇、研究的角度新穎，并且使用多套數(shù)據(jù)進行扎實的論證。正所謂干濕結(jié)合才是王道，只有發(fā)揮兩大科研手段的優(yōu)勢，才能做出真正意義上的好文章，這篇文章在最后還對篩選出的關(guān)鍵分子進行了實驗驗證?？偟膩碚f，作者立足于肺腺癌患者的惡性細胞的晝夜節(jié)律紊亂而開發(fā)了一種新的算法計算晝夜節(jié)律紊亂分數(shù)（CRDscore），并在腫瘤進展、治療抵抗、代謝異質(zhì)性、TME重塑等多個角度證明了CRDscore的價值，全文結(jié)構(gòu)清晰，邏輯嚴密，因此非常值得我們學(xué)習(xí)。
1. 有關(guān)晝夜節(jié)律的那些事
考慮到很多人對晝夜節(jié)律的研究知之甚少，為方便大家理解，小編先通過兩篇之前發(fā)表的研究對晝夜節(jié)律的基礎(chǔ)知識進行科普。
眾所周知，大多數(shù)人每天都會拿出至少四分之一的時間用來睡覺，而且很多人都會有夜里睡不好白天沒精神的經(jīng)歷，由此可知晝夜節(jié)律對人體的影響是巨大的。并且2017年的諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(Nobel Prize in Physiology or Medicine)的獲獎?wù)?，就是三位在晝夜?jié)律研究方向上做出卓越貢獻的科學(xué)家，他們分別是美國布蘭迪大學(xué)的Jeffrey C. Hall， Michael Rosbash和美國洛克菲勒大學(xué)的Michael W. Young。
有關(guān)晝夜節(jié)律的研究方向有很多，而近些年才開始出現(xiàn)有關(guān)晝夜節(jié)律對腫瘤生長的研究。其中2020年發(fā)表在Science Advances 雜志上一篇題為 Circadian disruption promotes tumor-immune microenvironment remodeling favoring tumor cell proliferation的論文引起了腫瘤研究者的廣泛關(guān)注。
圖2：
研究人員想知道慢性時差如何影響癌細胞周圍的微環(huán)境，并對兩組注射了黑色素瘤細胞的老鼠進行了研究。第一組作為對照，暴露于正常的晝夜節(jié)律：12 小時的光照和 12 小時的黑暗。第二組模擬了慢性時差，明暗暴露每兩天偏移六小時，效果相當(dāng)于每周在 21 個時區(qū)漫游。一個月后，科學(xué)家觀察到，慢性時差組小鼠的腫瘤大約是對照組的三倍。
圖3：
他們還檢測了腫瘤周圍微環(huán)境，以及產(chǎn)生免疫細胞的脾臟和肝臟的樣本。研究人員發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠免疫系統(tǒng)對腫瘤的反應(yīng)方式截然不同。例如，在慢性時差組中，巨噬細胞等不同類型的免疫細胞水平出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，使其更傾向于促使腫瘤生長。同樣，其他免疫細胞和分子（包括細胞因子）的節(jié)律也被破壞。即使腫瘤沒有擴散到附近的器官，肝臟或脾臟中，科學(xué)家們也觀察到這兩個器官的免疫系統(tǒng)晝夜節(jié)律變化都受到了抑制。
2. Nature重磅研究揭示乳腺癌細胞夜間加速轉(zhuǎn)移
有關(guān)晝夜節(jié)律對腫瘤生長影響的另一項重磅研究，就是最近發(fā)表在Nature雜志上的一篇題為：The metastatic spread of breast cancer accelerates during sleep的研究。研究在乳腺癌患者和小鼠模型中都檢測到了意想不到的循環(huán)腫瘤細胞（CTC）動態(tài)生成模式，發(fā)現(xiàn)癌細胞的轉(zhuǎn)移與作息、特定激素水平密切相關(guān)，大多數(shù)自發(fā)的CTC血管內(nèi)滲事件發(fā)生在患者的睡眠期間。
圖4：
首先，研究人員共入組30名乳腺癌患者，包括21例早期乳腺癌和9例晚期乳腺癌患者。隨后，分別在上午10點（清醒）以及凌晨4點（熟睡）兩個階段收集其血液樣本。這些患者都處于未接受治療或暫時停止治療的狀態(tài)，且部分患者為早期未轉(zhuǎn)移階段，部分患者已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移。檢測結(jié)果顯示，大部分CTC都來自于夜間獲取的血液樣本。
此外，研究團隊證明了睡眠期的CTC很容易轉(zhuǎn)移，活躍期產(chǎn)生的 CTC缺乏轉(zhuǎn)移能力。CTC的單細胞RNA測序分析顯示，在睡眠期和活動期的乳腺癌患者和小鼠模型中，CTC的分子基因表達模式不同。其中，睡眠期間的基因表達由有絲分裂和細胞分裂基因主導(dǎo)，有絲分裂基因均在睡眠期顯著上調(diào)，從而提高了CTC的轉(zhuǎn)移能力。在活動期，患者和小鼠模型的CTC核糖體生物發(fā)生和基因翻譯通路的活性增強。此外，這種基因表達變化在原發(fā)腫瘤中也觀察到，表明這是乳腺癌細胞在疾病進展過程中發(fā)生的一種普遍現(xiàn)象。
圖5：
基于以上發(fā)現(xiàn)，研究人員認為具有高轉(zhuǎn)移傾向的CTC的自發(fā)產(chǎn)生并不是持續(xù)發(fā)生的，而是集中在患者的睡眠期，這一發(fā)現(xiàn)為針對癌癥轉(zhuǎn)移分析和治療提供了新的理論基礎(chǔ)。腫瘤的轉(zhuǎn)移擴散是通過CTC的血液播散實現(xiàn)的。但決定具有轉(zhuǎn)移能力的CTC產(chǎn)生的時間動態(tài)在很大程度上是不明確的，通常認為CTC是從不斷生長的腫瘤中脫落或由于機械損傷而脫落的。該研究發(fā)現(xiàn)，與活動期產(chǎn)生的CTC相比，睡眠期產(chǎn)生的CTC分裂更快，因此更可能形成腫瘤轉(zhuǎn)移。
文章讀到這，可能很多能看懂這項研究的腫瘤患者都睡不著覺了。但是這項研究的作者Qing-Jun Meng告誡人們，不要將睡眠視為癌癥患者的敵人。大家更需要注意的是相對于擁有正常睡眠的腫瘤患者，每晚睡眠時間通常少于7小時的人死亡風(fēng)險更高，且科學(xué)家已經(jīng)證實晝夜節(jié)律擾亂的老鼠，其癌癥轉(zhuǎn)移得更快。老祖宗的話永遠都是對的，吃得好睡得好身體才倍棒。因此，好的身體才有較強的免疫功能，才能更好的控制腫瘤。
3. 晝夜節(jié)律紊亂與肺腺癌的不良預(yù)后和耐藥性有關(guān)
在了解有關(guān)晝夜節(jié)律基礎(chǔ)知識后，小編開始介紹今天這篇文章的主要內(nèi)容。
這項研究的作者首先整合了來自 GSE131907和 GSE123904的 30 名 LUAD 患者的原發(fā)(n = 17) 、遠處轉(zhuǎn)移(n = 10) 和化療期間(n = 3)）腫瘤組織的單細胞數(shù)據(jù)。隨后，按照上皮評分鑒定出惡性細胞，發(fā)現(xiàn)惡性細胞的數(shù)量隨著癌癥階段的進展而增加。緊接著，作者又發(fā)現(xiàn)惡性細胞來自相應(yīng)cluster在不同樣本的相對比例明顯不同，這說明了惡性細胞的異質(zhì)性。隨后對惡性細胞的2091個晝夜節(jié)律相關(guān)基因的矩陣進行WGCNA分析，對相關(guān)的358的基因的網(wǎng)絡(luò)進行了可視化。最后，作者基于358個基因開發(fā)了算法量化惡性細胞的CRD，隨后對單細胞數(shù)據(jù)按照CRDscore著色。通過對CRDhigh和CRDlow組進行了富集分析，CRDhigh組顯示糖酵解、G2M檢查點、MYC靶通路等影響腫瘤生長的相關(guān)通路。對不同樣本來源的惡性細胞進行GSVA分析發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移患者的惡性細胞CRD、EMT和血管生成評分更高而化療后患者的DNA修復(fù)、p53相關(guān)的凋亡通路更為活躍。
圖6：
隨后，作者在另一個獨立的接受了TKI治療的22名肺癌患者的單細胞隊列中研究了CRDscore與腫瘤耐藥之間的關(guān)系。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)惡性細胞在PD（progressive disease）組患者中比例更高且具有更高的CRDscore惡性細胞有較高的TKI組特異性。通過按照TKI打分和CRDscore打分進行分組后，作者發(fā)現(xiàn)CRDhigh的細胞大多都在PD組。按照不同分組比較，PD組、轉(zhuǎn)移組和晚期組的CRDscore較高。最后，作者將患者按照CRDscore分為了兩組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRDhigh組的患者TKI反應(yīng)率顯著低于CRDlow組。
圖7：
緊接著，作者將兩組病人的表達數(shù)據(jù)差異分析然后富集分析發(fā)現(xiàn)糖酵解、氧化磷酸化和自噬途徑在CRDhigh的PD和TN（before initiating targeted therapy）患者中同時富集，以上結(jié)果表明CRDscore高可能與TKI耐藥有關(guān)。此外，細胞因子通路在CRDhigh組被激活而與TKI結(jié)果無關(guān)，在PD和RD（complete or partial response state）之間糖酵解和細胞衰老信號的激活存在顯著差異。糖脂代謝相關(guān)基因如GPI、IDH1和DLD在CRDhigh患者的惡性細胞中高表達，G6PD、HK2、ALOX5和DGKA的表達水平與CRDScore呈正相關(guān)。表明能量代謝與CRD之間的聯(lián)系可以解釋惡性細胞的耐藥狀態(tài)。
4.肺腺癌細胞晝夜節(jié)律基因的相互作用和功能驗證
利用單細胞數(shù)據(jù)進行細胞通訊分析可以在單個細胞水平揭示各種細胞之間的相互調(diào)節(jié)作用，作者通過細胞通訊展示CRD高低組惡性細胞、巨噬細胞與T細胞亞群的配受體相互作用，結(jié)果顯示CRD改變了惡性細胞的趨化因子總體表達水平，CRDhigh抑制了惡性細胞產(chǎn)生的共刺激信號而共抑制細胞因子顯著升高這可能是T細胞減少和耗竭的原因。CRD下的M1和M2巨噬細胞對T細胞表現(xiàn)出不同的共抑制和共刺激信號效應(yīng)。惡性細胞和巨噬細胞協(xié)同作用激活了CRDhigh組的Th2和Treg，誘導(dǎo)一組協(xié)同調(diào)節(jié)的LRS則增強了CD8+T細胞與CRDLOW的積累。研究CRDhigh中被激活的細胞因子通路發(fā)現(xiàn)這些通路的活性水平與源自T/巨噬細胞的細胞因子信號正相關(guān)，這說明了CRD不同對TME組成的影響，CRD可能是LUAD中T細胞積累的主要調(diào)節(jié)因子。
圖8：
最后，作者用體外細胞功能實驗驗證了自己的發(fā)現(xiàn)，即在支氣管上皮細胞系 BEAS-2B 中檢測到核心晝夜節(jié)律基因表達的變化，但在 NSCLC（A549 和 H1299）細胞中表現(xiàn)出不同的特征，與對照細胞相比，H1299 細胞中 CLOCK 的表達顯著增加。在使用 siRNA (siCLOCK) 或褪黑激素預(yù)處理敲低 CLOCK 后，細胞顯示出侵襲性受損。
隨后，作者通過RNA測序評估了基因表達模式，總鑒定基因的PCA顯示治療組明顯聚集，褪黑素處理組與對照組差異大于siCLOCK組與對照組之間的差異，對照組的內(nèi)部變異小于在治療組中。對組間的差異表達基因進行GO分析，揭示了接受抗 CRD 治療的細胞的獨特特征。褪黑激素處理細胞特有的GO術(shù)語與晝夜節(jié)律、能量穩(wěn)態(tài)和對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等有關(guān)，且CRDscore與EMT的標(biāo)志物之一SNAIL的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)，褪黑激素孵育可以顯著抑制 CRDscore 和 SNAIL 的蛋白質(zhì)水平。證明了抗CRD治療可以減弱CRD狀態(tài)以及癌細胞的侵襲能力。此外，根據(jù)DEGs的GSEA，發(fā)現(xiàn)褪黑素顯著逆轉(zhuǎn)缺氧和衰老信號，這可能提示了新的方向。
圖9：
由于文章內(nèi)容較多，Immugent只挑出幾幅主圖進行講解，想系統(tǒng)學(xué)習(xí)這篇文章的小伙伴可以去認真研讀一下原文?？偟膩碚f就是作者立足于肺腺癌患者的惡性細胞的晝夜節(jié)律紊亂而開發(fā)了一種新的算法計算晝夜節(jié)律紊亂分數(shù)（CRDscore），并在腫瘤進展、治療抵抗、代謝異質(zhì)性、TME重塑等多個角度證明了CRDscore的價值，在單細胞和bulk水平驗證了結(jié)論并在體外功能實驗驗證了抗CRD治療可以減弱 CRD 和癌細胞的侵襲性。為 CRD 在癌癥進展和治療抵抗中的作用提供了新的見解。研究結(jié)果加深了對由 CRD 引起的代謝異質(zhì)性和 TME 重塑的理解。
5.展望
到目前這個行情，想依靠純生信發(fā)高分文章就必須有新穎且高端的科學(xué)問題，今天分享的這篇文章就是著手于晝夜節(jié)律這個科研熱點，但它又不是生硬的蹭科研熱點。從這篇文章發(fā)表的時間看（4月份），是早于今年的那篇Nature的（7月份），因此小編相信這個文章的立意肯定是作者在平時對相關(guān)領(lǐng)域的領(lǐng)悟而發(fā)現(xiàn)的。
此外，這篇文章的作者將要說的故事邏輯一步步展開，逐漸深入，而且每一步都有堅實的數(shù)據(jù)分析做支撐。雖然最后有實驗驗證，但都是一些最基本的細胞實驗，這肯定不是這篇文章能發(fā)表在12+的主要原因。因此，這篇文章之所以能被編輯喜愛，肯定是因為其基于多套數(shù)據(jù)，包括單細胞數(shù)據(jù)和bulk數(shù)據(jù)的互相驗證，這些都值得我們學(xué)習(xí)。
晝夜節(jié)律對機體的影響是一個非常重要的科學(xué)問題，而且這可以做一系列的研究。特別是在如今的社會，很多年輕人普遍晝夜顛倒，這會不會和腫瘤發(fā)病率升高有關(guān)？其次，除了腫瘤，其它疾病，如自身免疫病，免疫缺陷病是否也和晝夜節(jié)律相關(guān)？這些都還是未知。這篇文章只是對晝夜節(jié)律對肺癌的影響進行研究，那對其他腫瘤的影響呢？特別是一些內(nèi)分泌型腫瘤，小編相信也可能會有潛在的重要發(fā)現(xiàn)。但是，歸根結(jié)底，無論從哪個角度出發(fā)，都要聯(lián)系實際的臨床意義；而且如果先從數(shù)據(jù)挖掘著手，必須保證有龐大的公共數(shù)據(jù)做支撐；最后，如果能設(shè)計一些簡單的實驗進行后續(xù)驗證，即使不能作為文章的主要亮點，但仍會使編輯更加青睞于你的研究結(jié)果。
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