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細(xì)胞衰老和骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的最新機(jī)制

生信干貨 SXR ·2022年3月7日 17:50

嗨，早上好呀，相信經(jīng)過(guò)持續(xù)關(guān)注，大家已經(jīng)對(duì)細(xì)胞衰老有所了解。今天給大家分享一篇2022年1月份發(fā)表在風(fēng)濕病Top級(jí)別期刊的文章，Ann Rheum Dis（Q1，IF=19.103）。

METTL3介導(dǎo)的ATG7 m⁶A修飾調(diào)節(jié)自噬-GATA4軸促進(jìn)細(xì)胞衰老和骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展

摘要

本研究旨在探討成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（FLS）及其衰老在骨關(guān)節(jié)炎（OA）進(jìn)展中的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制。在患者和小鼠模型中，隨著OA的進(jìn)展，衰老的FLSs顯著增加。作者確定OA-FLS中發(fā)生自噬受損，導(dǎo)致衰老相關(guān)分泌表型（SASP）上調(diào)，自噬的重建通過(guò)抑制GATA4逆轉(zhuǎn)衰老表型。此外，作者首次觀察到過(guò)度m⁶A修飾對(duì)OA-FLS中的自噬產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)。該研究揭示了FLS衰老在OA進(jìn)展中的重要作用。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，靶向METTL3抑制可以緩解FLS的衰老，限制OA的發(fā)展，為OA治療提供了一種潛在的策略。

背景

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是晚年最常見的關(guān)節(jié)疾病，其主要特征是軟骨基質(zhì)逐漸喪失，并伴有其他關(guān)節(jié)成分的病理變化，包括軟骨下骨硬化和滑膜炎癥。據(jù)報(bào)道，偶發(fā)癥狀性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎在55至64歲之間達(dá)到高峰。在老年人中，多種與衰老相關(guān)的因素可能有助于OA的發(fā)展。線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和自噬減少改變軟骨細(xì)胞功能，促進(jìn)分解代謝過(guò)程和合成代謝過(guò)程中的細(xì)胞死亡。因此，提高對(duì)衰老如何促進(jìn)OA進(jìn)展的理解，將為減緩或停止OA提供新的策略。衰老細(xì)胞的長(zhǎng)期存在與組織功能喪失和OA等與年齡相關(guān)的慢性疾病密切相關(guān)。細(xì)胞衰老是衰老的重要標(biāo)志，軟骨細(xì)胞在衰老和OA進(jìn)展過(guò)程中具有衰老細(xì)胞的各種特征。據(jù)報(bào)道，在OA的發(fā)病機(jī)制中，大量滑膜細(xì)胞衰老。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞依賴自噬作為維持正常功能和存活的主要機(jī)制。在衰老過(guò)程中，軟骨細(xì)胞中的自噬逐漸減少，從而導(dǎo)致衰老，最終導(dǎo)致OA嚴(yán)重程度加重。然而，OA進(jìn)展中自噬受損的機(jī)制尚不清楚。

N6-甲基腺苷（m⁶A）作為一種廣泛的RNA轉(zhuǎn)錄后修飾，決定信使RNA（mRNA）的穩(wěn)定性、剪接、運(yùn)輸、定位和翻譯效率，深入?yún)⑴c各種細(xì)胞過(guò)程，包括DNA損傷、自噬和細(xì)胞衰老。最近，有報(bào)道稱，m⁶A甲基轉(zhuǎn)移酶的核心成分甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3）在人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜中顯著升高。METTL3基因敲低可有效抑制成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（FLS）中的炎癥和MMP因子表達(dá)。然而，m⁶A修飾的生物學(xué)意義以及FLS細(xì)胞衰老的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制仍不完全清楚。

一句話總結(jié)現(xiàn)狀：衰老細(xì)胞的長(zhǎng)期存在與骨關(guān)節(jié)炎（OA）的發(fā)展密切相關(guān)，但潛在的機(jī)制仍不清楚。

在這項(xiàng)研究中，作者首次在體外和體內(nèi)證明了衰老FLS在OA進(jìn)展中的關(guān)鍵作用，并發(fā)現(xiàn)m⁶A修飾與FLS衰老之間存在正相關(guān)。METTL3以m⁶A-YTHDF2依賴的方式影響自噬相關(guān)7（ATG7）mRNA的穩(wěn)定性，從而影響自噬活性，進(jìn)而促進(jìn)FLS衰老和OA進(jìn)展。

材料方法

作者收集正常和OA患者的滑膜組織，通過(guò)免疫熒光和免疫印跡分析滑膜FLS的衰老；通過(guò)N6-甲基腺苷（m⁶A）-甲基化RNA和RNA免疫沉淀分析，探討了甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3）在自噬調(diào)節(jié)中的作用；對(duì)進(jìn)行內(nèi)側(cè)半月板（DMM）手術(shù)的小鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)注射pAAV9（含有靶向METTL3的小干擾RNA（siRNA））或不注射pAAV9，進(jìn)行組織學(xué)分析以確定軟骨損傷。

結(jié)果

FLS衰老和自噬受損與OA的進(jìn)展密切相關(guān)

為了探索細(xì)胞衰老在OA發(fā)展中的作用，作者首先檢測(cè)了人類OA患者滑膜組織中衰老細(xì)胞的典型生物標(biāo)記物p16^INK4a和p21的表達(dá)。OA患者滑膜中二者的蛋白質(zhì)和mRNA水平顯著升高（圖1A-D）。作者進(jìn)一步觀察了OA滑膜組織中衰老FLS的積累和表型特征，p16^INK4a和FLS標(biāo)記物波形蛋白的雙陽(yáng)性免疫染色證實(shí)了這一點(diǎn)（圖1E）。OA患者滑膜中自噬小泡的積聚減少，表明OA滑膜中自噬不足（圖1F）。通過(guò)DMM建立了創(chuàng)傷后OA模型，作者發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)小鼠相比，DMM小鼠滑膜中p16INK4a陽(yáng)性FLS的數(shù)量以時(shí)間依賴性的方式顯著增加（圖1G）。軟骨降解和OARSI（Osteoarthritis Research Society International）評(píng)分隨時(shí)間顯著加重（圖1H），這與增強(qiáng)的FLS衰老密切相關(guān)（圖1I）。此外，作者還證明，在DMM誘導(dǎo)的OA進(jìn)展過(guò)程中，LC3B的表達(dá)顯著降低（圖1J），這與OARSI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（圖1K）。這些結(jié)果表明FLS衰老和自噬受損與OA進(jìn)展密切相關(guān)。

衰老的FLS有助于軟骨細(xì)胞在體內(nèi)和體外的分解代謝作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證衰老的FLS是否能加速OA的病理進(jìn)展，作者將人類軟骨細(xì)胞（C28/I2細(xì)胞）與OA患者的原代FLS（OA-FLS）或非OA患者的FLS（Con-FLS，圖2A）共同培養(yǎng)。有趣的是，在與OA-FLS共培養(yǎng)后，檢測(cè)到C28/I2細(xì)胞中MMP13和ADAMTS5的表達(dá)增加，II型膠原的表達(dá)減少（圖2B，C）。此外，為了進(jìn)一步研究衰老的FLS對(duì)體內(nèi)軟骨降解的影響，作者使用博萊霉素（一種DNA損傷化學(xué)劑）誘導(dǎo)小鼠FLS中的細(xì)胞衰老，然后未經(jīng)DMM手術(shù)的小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射2.5×10⁵正常FLSs或博萊霉素誘導(dǎo)的衰老FLSs（圖2D）。在第一次注射后第56天，作者發(fā)現(xiàn)注射衰老FLSs的小鼠與注射正常FLSs的小鼠相比，safranin O染色減少，II型膠原表達(dá)降低（圖2E，F(xiàn)），同時(shí)滑膜和軟骨中p16^INK4a表達(dá)升高（圖2G，H）。這表明外源性注射衰老的FLS可引發(fā)軟骨功能障礙，并誘導(dǎo)滑膜和軟骨衰老。

OA患者和DMM誘導(dǎo)的OA小鼠的衰老FLS中的自噬受損

在OA和DMM小鼠模型患者中，F(xiàn)LSs中LC3B表達(dá)降低（圖3A、B）。p16^INK4a陽(yáng)性細(xì)胞中的LC3B顯著降低（圖3C、D）。為了證實(shí)OA-FLS中自噬結(jié)構(gòu)的減少是由自噬損傷還是自噬降解增強(qiáng)引起的，作者使用了自噬通量抑制劑巴非霉素，它可以通過(guò)防止溶酶體降解增加LC3B。巴非霉素處理增加了Con FLS中LC3B點(diǎn)狀細(xì)胞的數(shù)量，并提高了p62的水平。然而，巴非霉素治療并沒(méi)有增加OA-FLS中LC3B和p62的表達(dá)（圖3E，F(xiàn)），這表明OA-FLS缺乏進(jìn)一步自噬體形成的能力，并且OA-FLS中溶酶體的降解能力已經(jīng)處于較低水平。

FLS中受損的自噬以GATA4依賴性方式加速細(xì)胞衰老

為了評(píng)估自噬是否介導(dǎo)FLS衰老，作者進(jìn)行了額外的自噬激活和阻斷實(shí)驗(yàn)。一方面，雷帕霉素激活自噬有效增加了每個(gè)細(xì)胞的LC3B-II和LC3點(diǎn)狀蛋白質(zhì)水平，并抑制了一系列事件，包括p16^INK4a、p21和p62的表達(dá)（圖4A）。另一方面，通過(guò)3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制自噬可顯著降低LC3B-II水平，并伴有Con-FLS中p62、p16^INK4a和p21的表達(dá)升高（圖4B）。衰老調(diào)節(jié)劑GATA4在體內(nèi)和體外OA-FLS中顯著增加（圖4C、D）。此外，在OA-FLS中通過(guò)雷帕霉素恢復(fù)自噬可有效降低GATA4的表達(dá)，而3-MA治療顯著提高Con-FLS中GATA4的蛋白水平（圖4A，B）。GATA4基因敲低減輕了3-MA誘導(dǎo)的p16^INK4a、p21和SASP的表達(dá)（圖4E、F）。相反，GATA4的上調(diào)可能有助于p16^INK4a、p21和SASP的表達(dá)（圖4G，H）。

升高的m⁶A水平與OA-FLS中的自噬受損相關(guān)

為了確定m⁶A修飾是否參與調(diào)節(jié)OA發(fā)展過(guò)程中FLS中的自噬活性，使用免疫熒光法測(cè)定m⁶A的水平。在OA患者和DMM小鼠模型的FLS中，m⁶A表達(dá)均顯著增加（圖5A-C）。鑒于m⁶A修飾主要受m⁶A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的調(diào)節(jié)，作者測(cè)量了OA滑膜和OA-FLSs中相關(guān)復(fù)合物的mRNA水平，除了METTL3的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，而其他基因的mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著變化。從OA患者滑膜分離的FLS中METTL3的蛋白質(zhì)水平也顯著升高（圖5D，E）。通過(guò)對(duì)人類OA滑膜和DMM誘導(dǎo)的OA模型中使用免疫熒光染色對(duì)波形蛋白和METTL3進(jìn)行雙重標(biāo)記，進(jìn)一步證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)（圖5F，G）。METTL3的上調(diào)提高了m⁶A水平，伴隨著LC3B-II的表達(dá)降低，p62和GATA4的表達(dá)增強(qiáng)（圖5H）。相反，METTL3基因敲低降低了OA-FLS中m⁶A的水平，上調(diào)了LC3B-II的表達(dá)，并抑制了p62和GATA4的蛋白水平（圖5I）。這些結(jié)果表明，METTL3介導(dǎo)的m⁶A修飾在FLS中自噬調(diào)節(jié)的衰老中起關(guān)鍵作用。

METTL3介導(dǎo)的m⁶A修飾以YTHDF2依賴性方式誘導(dǎo)ATG7轉(zhuǎn)錄本的衰變

在人類OA-FLSs和DMM小鼠模型中，ATG7蛋白水平持續(xù)顯著降低（圖6A，B）。METTL3的上調(diào)顯著降低了ATG7的表達(dá)（圖6C）。相比之下，METTL3基因敲低上調(diào)了OA-FLS中ATG7的表達(dá)（圖6D）。ATG7的上調(diào)有效緩解了METTL3誘導(dǎo)的LC3B-II減少，并降低了Con-FLS中p62和GATA4的表達(dá)（圖6E）。ATG7的敲低也抑制了METTL3敲低誘導(dǎo)的LC3B-II增加，并提高了Con FLS中p62和GATA4的水平（圖6F），表明METTL3誘導(dǎo)的FLS自噬缺陷是通過(guò)抑制ATG7介導(dǎo)的。接下來(lái)，作者對(duì)ATG7轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)編碼序列區(qū)內(nèi)有三個(gè)m⁶A修飾位點(diǎn)，3′-非翻譯區(qū)（UTR）內(nèi)有五個(gè)m⁶A修飾位點(diǎn)（圖6G）。m⁶A RNA免疫沉淀（RIP）分析表明，m⁶A在位點(diǎn)1、2、4、5和7處顯著富集（圖6H）。與Con-FLS相比，OA-FLS中位點(diǎn)4和7的m⁶A富集顯著增加（圖6I），METTL3敲除后m⁶A富集顯著減少（圖6J）。這些結(jié)果表明METTL3靶向ATG7轉(zhuǎn)錄本，并以m⁶A依賴的方式調(diào)節(jié)ATG7。據(jù)報(bào)道，YTHDF1促進(jìn)靶向m⁶A修飾mRNA的翻譯，而YTHDF2選擇性識(shí)別并破壞m⁶A修飾mRNA的穩(wěn)定性。作者發(fā)現(xiàn)，YTHDF2基因的敲低顯著減輕了METTL3誘導(dǎo)的ATG7蛋白表達(dá)的降低，而并不影響ATG7蛋白的表達(dá)。這表明METTL3修飾ATG7的m⁶A mRNA是YTHDF2的靶點(diǎn)（圖6K）。此外，TG7與YTHDF2相互作用，但與YTHDF1無(wú)關(guān)（圖6L，M）。上述結(jié)果表明METTL3以YTHDF2依賴的方式調(diào)節(jié)ATG7的表達(dá)。

圖6 METTL3介導(dǎo)的m⁶A修飾以YTHDF2依賴性方式誘導(dǎo)ATG7轉(zhuǎn)錄本衰變

METTL3在體外調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老和SASP表達(dá)

作者通過(guò)轉(zhuǎn)染METTL3質(zhì)粒在人類FLS中過(guò)度表達(dá)METTL3，METTL3的上調(diào)顯著提高了人類FLS中p16^INK4a和p21的表達(dá)（圖7A，B）和SASP的mRNA水平（圖7B）。β-半乳糖苷酶分析也證實(shí)METTL3促進(jìn)FLSs的衰老（圖7C）。而METTL3基因敲低明顯抑制了OA-FLS中p16^INK4a和p21的表達(dá)（圖7D，E），并降低了SASP的表達(dá)和IL-1β的分泌（圖7E）。另外，METTL3基因敲低可有效緩解博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠FLS中p16^INK4a、p21和SASP的表達(dá)（圖7F），以及β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生（圖7G，H）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明METTL3可能作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)來(lái)?yè)p害FLS的細(xì)胞衰老。

圖7 METTL3在體外調(diào)節(jié)FLS中的細(xì)胞衰老和SASP表達(dá)

滑膜靶向METTL3抑制緩解了DMM小鼠模型中OA的進(jìn)展

作者將編碼滑膜成纖維細(xì)胞靶向肽基序（HAP-1）的DNA序列插入VP2結(jié)構(gòu)域的N-末端，以構(gòu)建FLS靶向的腺相關(guān)病毒載體（rAAV9.HAP-1）（圖8A）。與rAAV9相比，rAAV9.HAP-1的轉(zhuǎn)染效率略有提高，在ATDC5細(xì)胞中檢測(cè)到低增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）表達(dá)（圖8B，C）。關(guān)節(jié)內(nèi)注射AAV9.HAP-1-si-METTL3后，DMM小鼠在OA發(fā)育過(guò)程中進(jìn)行性軟骨降解顯著逆轉(zhuǎn)（圖8D，E）。此外，與用AAV9.HAP-1-NC治療的小鼠相比，用AAV9.HAP-1-si-METTL3治療的小鼠滑膜中的METTL3和p16^INK4a水平顯著降低（圖8F）。這些結(jié)果表明，通過(guò)向滑膜的AAV9.HAP-1衣殼傳遞si-METTL3可以抵消DMM誘導(dǎo)的OA小鼠模型中的OA進(jìn)展。

圖8滑膜靶向抑制METTL3可減輕DMM誘導(dǎo)的OA的病理進(jìn)展

總結(jié)

本文的研究結(jié)果擴(kuò)大了對(duì)METTL3在促進(jìn)細(xì)胞衰老和OA進(jìn)展中發(fā)揮基礎(chǔ)作用的機(jī)制的認(rèn)識(shí)。METTL3通過(guò)調(diào)節(jié)自噬并以m⁶A-YTHDF2依賴的方式影響ATG7轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性來(lái)實(shí)現(xiàn)這些功能（圖8G）。該研究強(qiáng)調(diào)了m⁶A甲基化機(jī)制在自噬中的功能重要性，這為了解METTL3調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老的潛在分子機(jī)制以及OA治療策略的發(fā)展提供了見解。

寫在最后

這篇文章讀下來(lái)像是領(lǐng)略了一場(chǎng)細(xì)胞衰老和OA之間的“視覺(jué)盛宴”，在欣賞之余是否隱隱擔(dān)心這么復(fù)雜多樣的研究一定得耗費(fèi)不少時(shí)間和精力吧，那有沒(méi)有更便捷的方式方法呢？當(dāng)然有！動(dòng)動(dòng)手指聯(lián)系生信人，為你提供高效專業(yè)的服務(wù)。