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大家好呀，今天分享的文章題為HPV+扁桃體癌中髓系細(xì)胞的單細(xì)胞分析，文章思路清晰，于今年一月發(fā)表在《Frontiers in Immunology》（IF = 8.786）上，讓我們來一起學(xué)習(xí)一下吧！
Single-cell analysis of myeloid cells in HPV+ tonsillar cancer
一、背景
扁桃體鱗狀細(xì)胞癌，簡稱短扁桃體癌（short tonsillar cancer，TC），是一種由扁桃體黏膜上皮細(xì)胞異常生長引起的頭頸部癌（head and neck cancer，HNC）。人類乳頭瘤病毒陽性（HPV+）扁桃體癌的發(fā)病率在過去幾十年里急劇上升。而髓系細(xì)胞是一個適當(dāng)?shù)闹委煱悬c，因為它們靠近病毒感染的腫瘤細(xì)胞，并且能夠在扁桃體內(nèi)協(xié)調(diào)抗原特異性免疫。然而，穩(wěn)態(tài)和炎癥性髓系細(xì)胞亞群之間的相互關(guān)系及其對患者生存的影響尚未被探索。本文使用單細(xì)胞測序來繪制HPV+扁桃體癌的髓系腔室。
二、結(jié)果
1、HPV+ TC中髓系腔室擴張（包括樹突狀細(xì)胞亞群、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和少量HLA-DR+粒細(xì)胞）
使用流式細(xì)胞術(shù)表征和量化CD45+ CD13+ HLA-DR+髓系細(xì)胞群，TC組CD13+HLA-DR+細(xì)胞頻率(n=8)較對側(cè)HT組(n=5)明顯增加，表明TC組髓腔擴大。為探究初始治療的TC患者髓系細(xì)胞的多樣性，從5個HPV+ TC活檢和1個配對的對側(cè)健康扁桃體（HT）中分選D45+ CD13+ HLA-DR+細(xì)胞進行分類，然后進行單細(xì)胞測序（圖1A）。經(jīng)過質(zhì)控和聚類，得到9502個細(xì)胞并劃分成12個細(xì)胞簇（圖1B）。其特征是MHC II類編碼轉(zhuǎn)錄本（如HLA-DRA、HLA-DRB1）和CD14（圖1C）的異質(zhì)表達(dá)在TC和HT中分布不同（圖1D）。對12個細(xì)胞簇進行差異表達(dá)的分析，并進行細(xì)胞亞群的注釋以及計算特征基因打分，發(fā)現(xiàn)cDC 1（簇3）在血液cDC1基因集得分較高；相反，cDC 2樣細(xì)胞（簇0和簇6）在血液中的cDC2基因集得分較高。而祖細(xì)胞DC簇表現(xiàn)出與細(xì)胞周期和祖細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記物，S和G2/M細(xì)胞周期階段評分較高。（圖1E，F(xiàn)）
2、DC譜系特異性亞群和細(xì)胞特性動態(tài)分析
作者又將DC重新劃分成七個細(xì)胞簇， cDC2樣的3個細(xì)胞簇特征為CLEC10A、CD1C和FCER1A的表達(dá)、血液和組織cDC2基因集的高評分以及其在TC和HT中的異質(zhì)分布（圖2A-C）。作者使用SCIENIC來評估細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖2D），發(fā)現(xiàn)cDC1祖DC和actDC在DC室中具有最明顯的調(diào)控作用，而cDC2樣細(xì)胞和DC5部分共享它們的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。actDCs的特征在于RELB、HIVEP1和IRF1/2調(diào)控因子的高活性。基于簇之間的歐式距離進行分層聚類以評估它們的轉(zhuǎn)錄組相似性（圖2E）。發(fā)現(xiàn)actDCs是最不同的組，結(jié)果與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果一致。接下來，作者利用RNA速率來分析細(xì)胞分化狀態(tài)（圖2F-H），發(fā)現(xiàn)CDC1和CDC2樣細(xì)胞分支的RNA速度都指向actDC。CLEC9A和CLEC10A的連續(xù)缺失分別證實了cDC1s和CDC2樣成熟為actDCs。RNA速度分析顯示了一個連續(xù)的狀態(tài)沿著祖細(xì)胞進入完全分化的cDC1簇，并發(fā)展到actDCs（圖2E）。cDC1成熟為actDCs，最初CD40表達(dá)上調(diào)，隨后CCR7、PRDM1、NFKB1、LAMP3、IDO1和MIR155HG表達(dá)上調(diào)。同樣分析了cDC2樣細(xì)胞，檢測到RUNX3 cDC2和MAFB+ LC到RUNX3+ cDC2的強方向性，這些cDC2隨后發(fā)展為actDC（圖2H）。最后， 作者使用RNA速度分析評估cDC1和cDC2樣細(xì)胞成熟為表達(dá)LAMP3的actDC的頻率（圖2I）。發(fā)現(xiàn)DC2樣細(xì)胞比cDC1成熟得更頻繁。在同一TC樣本中，cDC1和DC2樣成熟彼此之間并不相關(guān)，這表明這兩個過程是獨立的。
3、Mono-Mac子集顯示腫瘤階段的特定模式
作者又將Mono-Macs劃分成6類細(xì)胞，它們在TC患者的TNM分期上具有不同的分布（圖3A-C）。六簇細(xì)胞高表達(dá)不同的基因，值得注意的是，M1和M2相關(guān)基因并沒有區(qū)分Mono-Macs簇，表明M1/M2的基因不能區(qū)分這兩者之間的差異。無論腫瘤分期如何，除CXCL-Macro外，所有的Mono-Macs集群都在HT和TC中被發(fā)現(xiàn)。而CXCL-Macro僅在晚期原發(fā)腫瘤中檢測到（圖3B）。作者評估了Mono-Macs集群中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)活性和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)（圖3D），Mono-Macs譜系共同表達(dá)FOS和FOSB，其中單核細(xì)胞具有更高的調(diào)控活性，基于簇之間的歐式距離層次聚類比較了Mono-Macs的轉(zhuǎn)錄組相似性（圖3E），單核細(xì)胞和ISG（干擾素刺激基因）單核細(xì)胞，NLRP3和C1Q-Mac，以及CXCL和act-Mac分別配對一起。RNA速率分析發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞和ISG單核細(xì)胞分化為NLRP3和C1Q-Mac，然后分別極化為CXCL和act-Mac。接下來，作者通過分析高可變基因來評估Mono-Macs發(fā)育軌跡中的轉(zhuǎn)錄組變化（圖3F），發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞、ISG單核細(xì)胞、NLRP3和C1Q-Mac上調(diào)IL1B和OLR1的表達(dá)，而這些基因在CXCL和act-Macro激活時表達(dá)顯著下調(diào)。單核細(xì)胞和NLRP3-Mac具有NLRP3、S100A9、AQP9和FCN1的活躍轉(zhuǎn)錄特征。在進入CXCL-Mac時，這些基因上調(diào)MMP10和CXCL5。相反，ISG 單核細(xì)胞的ISG20和IDO1轉(zhuǎn)錄活躍，并在分化為C1Q和acts時分別上調(diào)HLA-DPB1、IL4I1和IRF4。這些結(jié)果共同表明，在Mono-Macs譜系軌跡的不同階段存在一個核心轉(zhuǎn)錄程序。為了深入了解兩個平行的Mono-Mac分化過程，我們在act-Mac和CXCL-Macros簇之間進行成對DGEA（differential gene expression analysis），然后進行GSEA（圖3G）。act-Mac的特點是抗原呈遞相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的高表達(dá)和相應(yīng)途徑的富集。反過來，CXCL-Macros的特征是與粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞趨化相關(guān)的趨化基因、血管生成和與基質(zhì)重塑途徑相關(guān)的基因的高表達(dá)。
4、TC和配對HT中髓系異質(zhì)性的驗證
作者通過免疫熒光驗證scRNA-seq在蛋白水平上檢測到的髓系。對髓系細(xì)胞簇進行DGEA分析來選擇蛋白靶點，使用scRNA-seq分析中鑒定的基因編碼的蛋白質(zhì)（XCR 1、CD1c、CD 14、CD 5、CCR 7、CD 1A、CD 207、SDC 2、HLA-DRA、CD 300 E、FCGR 3A和TNFSF 10）的抗體組評估了TC和HT衍生的單細(xì)胞懸液（圖4A），鑒定了基因的表達(dá)并且加入了免疫檢查點PD-L1、PD-L2、LAG3和BTLA以及共刺激蛋白CD40的抗體和B細(xì)胞抗體（圖4B）。通過流式細(xì)胞術(shù)分析了10個低溫保存的單細(xì)胞懸液，分別對應(yīng)于7個TC和3對HT的活檢。經(jīng)過單線態(tài)過濾后，將活的CD45+ HLADR+ CD19- CD20-細(xì)胞連接起來，并在tSNE空間內(nèi)可視化。觀察到除CD16、LAG3、Ttrail、BTLA、CD34和CD300E外，所有標(biāo)記物都有清晰的信號（圖4C）。作者又建立了一種門控策略來定義人類TC和HT中的幾種髓系群體，并比較了它們的PD-L1、PD-L2、HLA-DR、CCR7和CD40的水平（圖4D-F），并發(fā)現(xiàn)每個亞群特異表達(dá)的基因和區(qū)分亞型的基因。為了評估TME誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組變化，用 scRNA-seq數(shù)據(jù)集中對TC和HT髓系群體進行了DGEA比較。TC中的祖DC表達(dá)了更高水平的cDC1典型基因和細(xì)胞周期基因，分別通過血液cDC1和細(xì)胞周期評分的富集來說明。相比之下，HT中的祖DC具有較高水平的典型cDC2基因和血液cDC2基因集評分。通過比較TC和HT之間的DEG，觀察到所有DC簇中IFN反應(yīng)相關(guān)基因的共同增加。相反，TC中所有髓系群體均顯示出炎癥小體調(diào)控基因MTRNR2L12、DNASE1L3和LGALS2以及MHC-II編碼基因的下調(diào)。
5、在頭頸部癌（HNC）患者中，cDC1s、活化的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞與HNC患者的生存期延長相關(guān)
作者試圖評估TC和HT以及其它HNC中髓系群體的存在，訪問了公開數(shù)據(jù)庫的單細(xì)胞數(shù)據(jù)，內(nèi)部的TC數(shù)據(jù)集中鑒定出的所有聚類簇也存在于HNC的其他亞型中。RUNX3-cDC2僅在頭頸部癌（HNC）中輕微存在，表明這種細(xì)胞狀態(tài)是針對上述健康組織的，并且發(fā)現(xiàn)HPV+和HPV-腫瘤之間的腫瘤浸潤髓系細(xì)胞的多樣性是相似的。為了研究HNC中髓系群體對預(yù)后的影響，從TC中分離出來的所有髓系簇進行了DGEA檢測，總共獲得了998個DEG。然后選擇公開的HNC單細(xì)胞數(shù)據(jù)篩選差異基因，獲得只在髓系中特異表達(dá)的3個DEG（圖5A-C）。分析每個標(biāo)簽基因高表達(dá)和低表達(dá)對應(yīng)HNC生存率的差異，發(fā)現(xiàn)cDC1、actDC和act-Macro基因集的高分與HNC的5年生存率增加相關(guān)。為了闡明cDC1、actDC和act-Macro與生存之間的關(guān)系，通過GSVA評估了TC中髓系腔室內(nèi)的亞群的GO term（圖5D），發(fā)現(xiàn)所有的樹突狀細(xì)胞，以及ISG單核狀細(xì)胞，在抗原呈遞途徑上的得分都高于巨噬細(xì)胞。具體來說，cDC1簇在與MHC I交叉呈現(xiàn)相關(guān)的通路中得分最高，其次是ISG單核細(xì)胞、DC5和actDCs。相比之下，所有的DC集群在通過MHC-II的呈現(xiàn)中都展現(xiàn)出相似的分?jǐn)?shù)，是高于Mono-Mac集群的。反過來，巨噬細(xì)胞簇的特征是與趨化、吞噬、ECM分解、血管生成和補體途徑相關(guān)的基因表達(dá)更高。值得注意的是，ISG單核細(xì)胞在細(xì)胞對IFNG的反應(yīng)和病毒生命周期的負(fù)調(diào)控中優(yōu)先富集，這表明該簇的TME特異性極化。
通過外部數(shù)據(jù)集進行受體配體分析，以確定TC中主要的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，以及TC較HT過表達(dá)的受體-配體基因?qū)?。作者的分析集中在髓樣?xì)胞與T/NK細(xì)胞亞群的相互作用上，因為后者在TME中有很高的豐度（圖5E，F(xiàn)）。與其他T/NK細(xì)胞相比，cDC1s的NK和組織駐留記憶（TRM）的CD8 T細(xì)胞具有更高的信號強度，其次是Treg亞群。此外，cDC1s通過XCL1/XCL2-XCR1以及CLEC2B-KLRB1與TRMCD8 T細(xì)胞、效應(yīng)記憶（EM）CD8 T細(xì)胞和NK細(xì)胞相互作用。根據(jù)預(yù)測的信號強度，actDCs和act-Macro的相互作用比cDC1更多樣化。actDCs和act-Macro都被預(yù)測通過NECTIN2-TIGIT與幾個T/NK-亞群相互作用。
三、小結(jié)
HPV驅(qū)動的TC是以1型T細(xì)胞炎癥反應(yīng)為特征的HNC的一個亞群，作者使用單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)繪制了HPV+扁桃體癌的髓系腔室。通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析、基因標(biāo)記評分、調(diào)節(jié)子活性評估和RNA速率分析，獲得了一個髓系腔室動態(tài)快照，說明了不同髓系亞群的相互關(guān)系。作者觀察到HPV+扁桃體癌中髓系腔室的擴張，同時在DC和單核-巨噬細(xì)胞中均出現(xiàn)干擾素誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)。并且作者揭示了四種DC譜系的存在，兩種巨噬細(xì)胞極化過程，以及它們的序列成熟譜，篩選出髓系中與HNC生存相關(guān)的基因。本文研究思路清晰深入，對HPV+扁桃體癌髓系亞群分析的很深入，這種研究方式也是十分值得我們學(xué)習(xí)的。
參考文獻：Jimenez DG, Altunbulakli C, Swoboda S, Sobti A, Askmyr D, Ali A, Greiff L, Lindstedt M. Single-cell analysis of myeloid cells in HPV+ tonsillar cancer. Front Immunol. 2023 Jan 19;13:1087843. doi: 10.3389/fimmu.2022.1087843IF: 8.786 Q1 . PMID: 36741389; PMCID: PMC9893928.
