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隨著單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的爆發(fā)式增長(zhǎng)，對(duì)于不同細(xì)胞亞群之間互作及細(xì)胞通訊的解析成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。近期，一篇解讀黑色素瘤腫瘤細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞之間的異質(zhì)性串?dāng)_對(duì)臨床影響的研究于2022年7月發(fā)表在Frontiers in Immunology雜志（IF:8.786）上。研究囊括細(xì)胞狀態(tài)的從頭識(shí)別，基于受體-配體互作系統(tǒng)解析腫瘤細(xì)胞與CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞通訊，并揭示出一組關(guān)鍵的細(xì)胞亞群互作對(duì)，能夠影響患者的臨床獲益。分析流程環(huán)環(huán)相扣，可作為基于公共單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)挖掘分析的參考。
Single-Cell Transcriptomic Analysis Reveals the Crosstalk Propensity Between the Tumor Intermediate State and the CD8+ T Exhausted State to be Associated with Clinical Benefits in Melanoma
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示腫瘤中間狀態(tài)與CD8+ T細(xì)胞耗竭狀態(tài)的互作傾向性與黑色素瘤臨床獲益相關(guān)
黑色素瘤中腫瘤細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的互作異質(zhì)性導(dǎo)致了不同患者免疫治療臨床獲益的巨大差異。先前研究揭示出腫瘤微環(huán)境細(xì)胞的空間分布和功能狀態(tài)具有高度異質(zhì)性。而黑色素瘤中，腫瘤細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞之間是否存在串?dāng)_傾向，以及這種串?dāng)_傾向如何影響患者的臨床預(yù)后尚不清楚。本研究利用公開(kāi)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的異質(zhì)性功能狀態(tài)和他們之間廣泛的配體-受體互作。此外，基于細(xì)胞間通信強(qiáng)度和細(xì)胞狀態(tài)活性之間的關(guān)聯(lián)，作者確定了腫瘤中間狀態(tài)和CD8+T細(xì)胞耗竭狀態(tài)之間的串?dāng)_傾向。這種串?dāng)_傾向通過(guò)偽空間接近性、空間共定位和細(xì)胞內(nèi)/細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步得到了驗(yàn)證。在樣本水平上，腫瘤中間狀態(tài)和CD8+T細(xì)胞耗竭狀態(tài)的互作預(yù)示著患者的預(yù)后更好，而在免疫治療耐藥患者中觀察到兩者均減少。此外，基于這兩種細(xì)胞狀態(tài)確定的風(fēng)險(xiǎn)群體呈現(xiàn)腫瘤基因組突變和抗腫瘤免疫反應(yīng)狀態(tài)的差異。作者的研究強(qiáng)調(diào)了腫瘤中間狀態(tài)和CD8+T細(xì)胞耗竭狀態(tài)之間的串?dāng)_傾向，這可能為指導(dǎo)患者風(fēng)險(xiǎn)分層、預(yù)后標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)和潛在治療靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)提供參考。
二、研究背景
皮膚皮膚黑色素瘤(SKCM)是最致命的皮膚惡性腫瘤，具有高突變負(fù)荷和增加的細(xì)胞可塑性，腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性較高。最近，多篇研究證實(shí)了黑色素瘤中存在腫瘤細(xì)胞（3,4）和CD8+T細(xì)胞（4-6）的不同表型和轉(zhuǎn)錄亞群，通常被稱為不同的細(xì)胞狀態(tài)。MITF（黑素細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子）-變阻器模型揭示了黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的六種不同的表型狀態(tài)。這些細(xì)胞狀態(tài)根據(jù)MITF活性從高到低依次排列為高分化狀態(tài)、黑素細(xì)胞狀態(tài)、中間狀態(tài)、饑餓狀態(tài)、神經(jīng)嵴干樣細(xì)胞狀態(tài)和間充質(zhì)樣狀態(tài)（7）。腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞群在三個(gè)獨(dú)立的黑色素瘤隊(duì)列中顯示出相似的異質(zhì)性亞群，包括初始/記憶，細(xì)胞毒性，過(guò)渡狀態(tài)和耗竭狀態(tài)的CD8+T細(xì)胞亞群。對(duì)細(xì)胞狀態(tài)異質(zhì)性的分析對(duì)探究不同細(xì)胞狀態(tài)的機(jī)制以及細(xì)胞狀態(tài)如何影響黑色素瘤的進(jìn)展，如轉(zhuǎn)移和治療反應(yīng)至關(guān)重要。
三、研究主要內(nèi)容及結(jié)果
1.從頭推斷腫瘤及CD8 T 細(xì)胞的狀態(tài)亞群
根據(jù)以往研究（3）中與腫瘤細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控狀態(tài)的單元（regulons, Table S1），利用AUCell算法計(jì)算2018個(gè)腫瘤細(xì)胞的調(diào)控活性得分譜，并進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的一致性聚類分析，識(shí)別了4種細(xì)胞狀態(tài)(圖1A)。不同腫瘤細(xì)胞狀態(tài)可以在黑色素瘤患者中共存(圖1B)，這種現(xiàn)象已在多個(gè)研究中報(bào)道過(guò)（4,1 3）。黑素細(xì)胞狀態(tài)表現(xiàn)出譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控活性的升高(如SOX10和MITF)和顯著升高的色素沉著和增殖潛能(圖1A、C、D)。與黑素細(xì)胞狀態(tài)相比，間充質(zhì)樣狀態(tài)失去了黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控活性，但具有顯著的更高的干性和侵襲潛能(圖1A，E，F(xiàn))。大部分腫瘤細(xì)胞處于中間狀態(tài)，受EGR3、NFATC2和SOX6的調(diào)控(圖1A)。
進(jìn)一步，識(shí)別1759個(gè)CD8+T細(xì)胞樣本中前2000個(gè)高變異基因，并基于這些基因的表達(dá)矩陣進(jìn)行主成分分析（PCA）?；赗包Seurat的FindClusters函數(shù)識(shí)別了6個(gè)CD8+ T細(xì)胞亞群，并進(jìn)行UMAP可視化。然后結(jié)合先前報(bào)道的（25）（Table S1）和FindAllMarkers函數(shù)識(shí)別的細(xì)胞狀態(tài)標(biāo)記基因?qū)D8+T細(xì)胞亞群進(jìn)行狀態(tài)注釋。同時(shí)，基于前2000個(gè)高變異基因，應(yīng)用Monocle2算法，構(gòu)建不同 CD8+ T細(xì)胞亞群的發(fā)育軌跡。
C1亞群標(biāo)記為耗竭狀態(tài)，高表達(dá)耗竭標(biāo)記物（如HAVCR2、PDCD1和LAG3）和細(xì)胞毒性相關(guān)基因（如GZMB、PRF1、GZMA和NKG7）。C2亞群被定義為一種過(guò)渡狀態(tài)。C3亞群富集初始/記憶T細(xì)胞相關(guān)基因（例如IL7R、CCR7、SELL和 TCF7）。上述三個(gè)主要細(xì)胞亞群的狀態(tài)定義與軌跡分析中的進(jìn)展過(guò)程相一致（圖2D）。此外，還有其他三個(gè)較小的亞群。這些CD8+ T細(xì)胞亞群在每個(gè)患者中所占的比例也不同（圖2E）。
2.基于配體-受體互作刻畫(huà)腫瘤及CD8 T 細(xì)胞的串?dāng)_景觀
整合5個(gè)已發(fā)表資源中的人類配體-受體對(duì)（Table S2）。這些注釋資源被用來(lái)推斷候選的細(xì)胞狀態(tài)特異性配體-受體互作，以構(gòu)建腫瘤-CD8+ T細(xì)胞互作組（圖S1B, C），并形成配體-受體互作網(wǎng)絡(luò)（圖S2A）。腫瘤細(xì)胞表達(dá)了相對(duì)高水平的與抗原呈遞和TGF-信號(hào)通路相關(guān)的趨化因子和配體，而相應(yīng)的受體在CD8+ T細(xì)胞中廣泛表達(dá)，這表明這些配體在誘導(dǎo)黑色素瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)中可能發(fā)揮了重要作用(圖3A)。相反，配體IFNG 及其相關(guān)的CD8+ T細(xì)胞中表達(dá)了促炎細(xì)胞因子TNF以及與腫瘤壞死因子家族和細(xì)胞毒性相關(guān)的配體，表明CD8+ T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷潛力。值得注意的是，在所有細(xì)胞狀態(tài)中，無(wú)論腫瘤細(xì)胞作為發(fā)送者還是受體，中間狀態(tài)腫瘤細(xì)胞具有最多的配體-受體互作（圖3B，C，S1D)。這些結(jié)果表明，中間狀態(tài)腫瘤細(xì)胞和神經(jīng)嵴樣腫瘤細(xì)胞可能更頻繁地與CD8+ T細(xì)胞發(fā)生串?dāng)_。
3.解讀腫瘤及CD8 T 細(xì)胞之間的串?dāng)_傾向性
為了進(jìn)一步識(shí)別細(xì)胞狀態(tài)特異的配體-受體互作，作者首先應(yīng)用NicheNet方法（41）計(jì)算每個(gè)信號(hào)接收細(xì)胞的配體活性（圖4A，B）。當(dāng)腫瘤細(xì)胞作為受體時(shí)，不同腫瘤細(xì)胞狀態(tài)下某些配體的活性存在明顯差異，如中間腫瘤細(xì)胞狀態(tài)接受最強(qiáng)的配體IFNG信號(hào)（圖4A，C）。但CD8+ T細(xì)胞中這種現(xiàn)象不太明顯。
使用與細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)的配體作為介質(zhì)，進(jìn)一步探索了細(xì)胞通訊和細(xì)胞狀態(tài)之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)腫瘤中間狀態(tài)細(xì)胞和CD8+T耗竭狀態(tài)之間具有顯著過(guò)出現(xiàn)的配體，并且觀察到觀察到腫瘤細(xì)胞對(duì)CD8+ T細(xì)胞發(fā)送信號(hào)（超幾何檢驗(yàn)，p<0.001），說(shuō)明腫瘤中間狀態(tài)細(xì)胞可能通過(guò)這些配體影響CD8+ T耗竭狀態(tài)細(xì)胞。
4.驗(yàn)證腫瘤中間狀態(tài)與CD8+ T耗竭狀態(tài)之間的串?dāng)_傾向
細(xì)胞的功能經(jīng)常會(huì)受到鄰近細(xì)胞的影響。作者隨后利用CSOmap算法重建腫瘤細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的三維偽空間(圖5A)，從空間角度驗(yàn)證這種串?dāng)_傾向。在偽空間中，緊密連接結(jié)構(gòu)(tightly linked structures)的主要部分是由耗竭的CD8+T細(xì)胞和中間狀態(tài)腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的(圖5B和C)，并在腫瘤細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的邊界處緊密連接(圖5D)。而且，耗竭的CD8+T細(xì)胞和中間狀態(tài)腫瘤細(xì)胞的整體互作細(xì)胞對(duì)最多(圖5E)，表明它們?cè)诘膫慰臻g接近性。偽空間接近性主要是由抗原呈遞和趨化因子相關(guān)的配體-受體相互作用引起的，如HLA-B-CANX和CXCL10-CXCR3(圖5F)。有趣的是，在一個(gè)黑素瘤微區(qū)測(cè)序數(shù)據(jù)（MEL1-1）中，在黑素瘤侵襲邊界呈現(xiàn)顯著增加的耗竭CD8+T細(xì)胞和中間狀態(tài)腫瘤細(xì)胞(ssGSEA score, 圖5G-I)。此外，在黑素瘤樣本的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)部分空間spot同時(shí)富集了耗竭的CD8+T細(xì)胞和中間狀態(tài)腫瘤細(xì)胞(ssGSEA score, 圖5J，K)。這些結(jié)果表明耗竭的CD8+T細(xì)胞和中間狀態(tài)腫瘤細(xì)胞的空間共定位。
為了進(jìn)一步研究哪些分子可能介導(dǎo)腫瘤中間狀態(tài)和CD8+T耗竭狀態(tài)之間的串?dāng)_傾向，作者構(gòu)建了一個(gè)細(xì)胞間/細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)(TF-配體-受體-TF)，并發(fā)現(xiàn)了多種信號(hào)通路參與其中(圖6A)。部分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程進(jìn)一步支持細(xì)胞通訊與細(xì)胞狀態(tài)之間的聯(lián)系。例如，PRDM1可以調(diào)節(jié)CD8+T耗竭細(xì)胞分泌的IFNG配體的表達(dá)水平，并與中間腫瘤細(xì)胞上的IFNGR1/IFNGR2受體結(jié)合，進(jìn)而激活下游的間充質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如FOS和NR3C1。隨后利用TCGA-SKCM和GDSC數(shù)據(jù)驗(yàn)證他們的關(guān)聯(lián)關(guān)系。
總之，這部分通過(guò)偽空間接近性、空間共定位和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)三個(gè)方面驗(yàn)證了腫瘤中間狀態(tài)和CD8+T耗竭狀態(tài)之間的串?dāng)_傾向。
腫瘤中間狀態(tài)與CD8+ T耗竭狀態(tài)與臨床獲益相關(guān)
隨后，作者探討了這種串?dāng)_傾向是否與患者的臨床獲益相關(guān)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型(COX-PH)和生存曲線分析表明，腫瘤中間狀態(tài)和CD8+T耗竭狀態(tài)都能顯著區(qū)分患者的總體生存(OS)以及無(wú)進(jìn)展間隔(PFI)(圖7A-C)。而且，兩個(gè)指標(biāo)都高的患者的OS顯著更長(zhǎng)(圖7D)。此外，作者進(jìn)一步評(píng)估腫瘤中間狀態(tài)和CD8+T耗竭狀態(tài)在免疫治療應(yīng)答中的作用。作者發(fā)現(xiàn)在TCGA-SKCM隊(duì)列中，IFN-gama反應(yīng)與腫瘤中間狀態(tài)和CD8+T耗竭狀態(tài)的ssGSEA評(píng)分之間存在顯著正相關(guān)(中間狀態(tài)：R=0.46，p<2.2e-16；耗竭：R=0.62，p<2.2e-16)(圖7E)。在anti-PD1在治療隊(duì)列中，應(yīng)答者的CD8+T耗竭狀態(tài)評(píng)分顯著高于無(wú)應(yīng)答者(圖7I)。綜上所述，在免疫治療耐藥樣本中，腫瘤中間狀態(tài)和CD8+T耗竭狀態(tài)與良好的預(yù)后協(xié)同相關(guān)。
風(fēng)險(xiǎn)群體的基因組突變和免疫特征刻畫(huà)
根據(jù)上述生存分析，我們將TCGA-SKCM隊(duì)列分為高低風(fēng)險(xiǎn)組，其中低風(fēng)險(xiǎn)組對(duì)應(yīng)腫瘤中間狀態(tài)較高、CD8+T耗竭狀態(tài)得分較高的樣本。作者首先探究了風(fēng)險(xiǎn)分組與先前定義的免疫亞型的關(guān)聯(lián)。對(duì)于泛癌免疫亞型，C2-interferon-gamma顯性亞型在低風(fēng)險(xiǎn)組中占顯著優(yōu)勢(shì)，而高風(fēng)險(xiǎn)組在C1-傷口愈合和C4-淋巴細(xì)胞缺失亞型中富集（圖8A）。作者還觀察了風(fēng)險(xiǎn)分組與先前定義的突變分子亞型之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，風(fēng)險(xiǎn)分組跨越了不同的突變分子亞型，且在不同分子亞型的分布上沒(méi)有顯著差異（圖8B）。
作者進(jìn)一步研究了低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)人群之間的基因組和免疫特征的差異。BRAF在樣本中發(fā)生高頻突變，且突變率在低風(fēng)險(xiǎn)組中顯著高于高風(fēng)險(xiǎn)組（突變頻率分別為59.4%和45%，p=0.006）。這與先前觀察的BRAF突變亞型在高低風(fēng)險(xiǎn)組的分布一致，預(yù)示了更長(zhǎng)的生存（圖8C，D）。與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，細(xì)胞粘附相關(guān)的VIT基因僅在高風(fēng)險(xiǎn)組中發(fā)生突變（突變頻率分別為6.3%和0%，p=0.0009，圖8E）。此外，在免疫浸潤(rùn)方面，低風(fēng)險(xiǎn)組的抗腫瘤免疫反應(yīng)相關(guān)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯升高，如CD8+ T、CD4+ T和活化的NK細(xì)胞（圖8F）。綜上所述，低風(fēng)險(xiǎn)組具有較高的BRAF突變和較強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，提示風(fēng)險(xiǎn)分組能夠反映腫瘤基因組信息和抗腫瘤免疫微環(huán)境特征。
文章基于通過(guò)公開(kāi)的scRNA-seq數(shù)據(jù)識(shí)別了腫瘤細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞的不同狀態(tài)亞群，發(fā)現(xiàn)并解讀了腫瘤中間狀態(tài)和CD8+ T耗竭狀態(tài)之間的串?dāng)_傾向以及對(duì)臨床預(yù)后的潛在應(yīng)用價(jià)值。
