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哈嘍，各位同學大家好，好久不見，甚是想念呢。今天小編想和大家分享的是一篇比較經典的文章（J Clin Lab Anal，2.3521），該工作主要基于構建壞死性凋亡相關的lncRNA特征預測頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的預后和免疫微環(huán)境，思路清晰，流程明確，方法簡單，對于生物信息初學者而言非常友好。
Construction of a necroptosis-related lncRNA signature to predict the prognosis and immune microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma
基于壞死性凋亡相關的lncRNA特征預測頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的預后和免疫微環(huán)境
已有研究表明壞死性凋亡相關基因是HNSCC的潛在生物標志物。因此，研究者意圖通過建立一組基于壞死性凋亡相關lncRNAs (nrlncRNAs)的風險模型來預測HNSCC患者的預后。研究者首先基于相關性分析識別與壞死性凋亡基因表達相關的lncRNA，進一步通過單因素Cox分析篩選與預后相關的lncRNA，并基于最小絕對收縮和選擇算子(LASSO)Cox回歸建立由6個lncRNA構成的nrlncRNA特征，對患者進行高低風險組分型，二者預后存在顯著差異。在nrlncRNA特征基礎上，研究者建立nomogram生存預測模型，并進一步比較不同風險患者在基因表達、免疫藥物響應、藥物敏感性、m6A、腫瘤干性等方面的差異（圖1）。
圖1.流程圖
1.數(shù)據(jù)
從TCGA獲取HNSC中轉錄組數(shù)據(jù)和臨床相關信息。將HNSC樣本以1：1的比例隨機分成訓練數(shù)據(jù)和驗證數(shù)據(jù)集合。
2.識別HNSCC的nrlncRNAs
研究者首先基于相關性分析識別出TCGA-HNSC數(shù)據(jù)集中與壞死性凋亡基因表達相關的694個lncRNA (相關系數(shù)>0.4，p<0.001)并構建互作網(wǎng)絡（圖2A），其中325個在腫瘤與正常樣本間發(fā)生差異表達的nrlncrna，包括299個nrlncrna在HNSCC患者中發(fā)生上調， 26個在HNSCC患者中發(fā)生下調（圖2B-2C）。
3. nrlncRNA風險模型的構建與驗證
單因素Cox回歸分析共發(fā)現(xiàn)29個nrlncRNAs與OS相關，其中10個nrlncRNAs與HNSCC預后不良有關，這29個nrlncRNAs均在HNSCC患者中發(fā)生上調（圖2D-2F）。研究者對這29個nrlncRNAs進行LASSO Cox回歸分析，最終建立由6個nlncRNA構成的nrlncRNAs特征打分（圖2G-2H）。
圖2. nrlncRNA風險模型的構建
根據(jù)nrlncRNA特征打分中位數(shù)，研究者分別對訓練，驗證以及所有患者進行高-低風險兩組分型(圖3A-C)，并對患者的生存狀態(tài)和特征nrlncRNA表達進行比較，結果表明高風險組患者預后較差，特征lncRNA在高低風險組中存在表達差異(圖3D-L)。
圖3. nrlncRNAs模型的預后價值
此外，在對不同年齡(圖4A、B)、性別(圖4C、D)、分級(圖4E、F)、分期(圖4G-N)等特定類型的樣本中，基于nrlncRNAs特征的高低風險組樣本間同樣存在預后差異，表明nrlncRNAs特征獨立于年齡，性別等臨床特征。該風險模型的AUC值為0.699(圖4O)，顯著優(yōu)于年齡、性別、分級、分期等臨床特征模型的分類效能(圖4P)。
圖4. nrlncRNAs模型與臨床特征的關系
此外，評估風險模型的獨立性以及包括年齡、性別、分級和分期在內的一些臨床特征。單因素Cox回歸分析(圖5A)和多因素Cox回歸分析(圖5B)結果表明年齡和分期是兩個獨立的預后參數(shù)。研究者通過進一步整合風險評分和獨立臨床因素，構建預測HNSCC患者5年生存概率的nomogram圖(圖5C-D)。
圖5.構建列線圖預測模型
4.基因集合富集分析
研究者進一步基于GSEA富集分析高低風險組患者在通路活性層面的差異，結果表明兩類患者在腫瘤侵襲和初次免疫應答等方面存在顯著差異（圖6A）。
5. 風險評分與免疫因子及腫瘤微環(huán)境的相關性
分別基于XCELL, TIMER, QUANTISEQ, MCP-counter, EPIC, CIBERSORT, and CIBERSORT-ABS等免疫浸潤分析工具對HNSCC患者的免疫細胞浸潤比例進行預測，并進一步比較不同風險患者在腫瘤微環(huán)境間的差異。結果表明，多種免疫細胞與風險評分呈負相關(如TIMER中的B細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、巨噬細胞)，提示低風險組具有較高的免疫浸潤狀態(tài)(圖6B)。低風險組中CD8+ T細胞、dc細胞、Tfh細胞、Th2細胞、til細胞浸潤較高，高危組巨噬細胞浸潤較高。GSEA富集分析結果同樣表明低風險組比高風險組具有更強的免疫相關功能，包括檢查點、溶細胞活性、HLA、炎癥促進、T細胞共抑制等(圖6C)。低風險組免疫評分高于高風險組組，基質評分低于高風險組；然而，兩組之間在ESTIMATE得分沒有顯著差異(圖6D)。此外，大多數(shù)免疫檢查點基因在低風險組中的激活程度更高(圖6E)。
6. 風險模型與藥物響應
基于pRRophetic包，研究者基于表達矩陣對患者的藥物反應進行預測，比較高低風險組對不同藥物的響應狀態(tài)，結果表明高風險組患者對多西他賽、吉西他濱化療的藥物敏感性可能較高，順鉑或紫杉醇在兩組樣本間無響應差異（圖6F）。
7. 風險模型與m6A相關基因和腫瘤干性的相關性分析
研究者進一步基于Wilcoxon檢驗探究風險評分與m6A基因的相關性，大多數(shù)m6A相關基因在低風險組中表達較高(圖6G)。此外，構建的風險特征與腫瘤干性打分顯著負相關(圖6H)。
圖6.風險評分與免疫浸潤、藥物響應、m6A表達和腫瘤干性的相關性
8. 基于特征nrlncRNAs的聚類分析
基于6個特征nrlncRNAs表達，研究者通過ConsensusClusterPlus包對患者進行聚類（圖7A)。大部分高危組患者被重新分組到聚類1；聚類2主要由低風險患者構成（圖7B），且聚類2的預后更好(圖7C)。主成分分析結果顯示，不同風險組和聚類形成不同的成分(圖7D)，tSNE降維結果中高低風險組和不同類別同樣可以很好區(qū)分(圖7E)。聚類1的免疫、基質和ESTIMATE得分低于聚類2（(圖7F)）。不同類別患者中，腫瘤免疫微環(huán)境存在顯著差異(圖7G)。此外，TNFRSF18、LAG3、CD244和TNFRSF14等免疫檢查點基因在聚類2中表達較高(圖7H)。聚類1對吉西他濱治療更敏感；聚類2對紫杉醇和多西他賽治療更敏感。順鉑響應在兩組間無顯著差異(圖7I)。
圖7. 基于特征nrlncRNAs的聚類分析
本篇文章的主要內容就是這些，思路清晰，方法簡單，是一篇比較基礎的生物信息學分析工作。當然，文章中還存在一些小問題，比如流程圖中的lasso錯寫成lasoo；沒有獨立的外部數(shù)據(jù)集合驗證；部分結果的描述過于簡單，沒有深層次描述結果的潛在生物意義等。同學們在進行自己的工作時要對這些問題多加注意，莫不要因為一些小的瑕疵就掩蓋掉美玉的本質哦。
今天的內容就是這些，我們下次再見啦~
參考文獻：
1. Construction of a necroptosis-related lncRNA signature to predict the prognosis and immune microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma
