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各位小伙伴，大家好呀！ 今天給大家?guī)淼氖且黄趩渭毎鸕NA測序數(shù)據(jù)分析人類胃癌器官特異性轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的文章；文章分析思路整體來說都是偏常規(guī)的分析，但是亮點在于作者將腫瘤微環(huán)境中的每一種免疫細胞都進行了細致入微的刻畫，非常適合大家在分析數(shù)據(jù)時開拓自己的思路，快來和小編一起看看吧~
研究背景
胃癌(GC)是全球第二大癌癥死亡原因，每年有103萬例，而亞洲胃癌發(fā)病率最高，占全球病例的70%。大多數(shù)GC患者被診斷為晚期和轉(zhuǎn)移期，再進行藥物治療時往往患者已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性，因此，手術(shù)治療已經(jīng)不再是治療胃癌的唯一方式。
腫瘤細胞可通過血液、淋巴系統(tǒng)和腹腔內(nèi)擴散侵入遠處部位以進行轉(zhuǎn)移，在轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細胞通過激活特定的基因和通路，向特定的器官進化適應(yīng)度并表現(xiàn)出趨向性，不同器官的轉(zhuǎn)移是胃癌診斷和治療面臨的最困難和最緊迫的問題。因此，精確繪制器官特異性轉(zhuǎn)移特征是至關(guān)重要的，特別是對于不同轉(zhuǎn)移的特異性治療策略的開發(fā)以及臨床診斷的潛在生物標(biāo)志物的識別。然而，胃癌向不同器官轉(zhuǎn)移的特點在很大程度上尚不清楚。
因此，作者收集了包括轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移共6名胃癌患者進行單細胞RNA測序，刻畫了胃癌患者腫瘤間和腫瘤內(nèi)部微環(huán)境異質(zhì)性的問題，更好地分析了胃癌不同器官轉(zhuǎn)移的模式。
二、主要結(jié)果
Result1: 刻畫原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性GC的單細胞轉(zhuǎn)錄圖譜
作者對6名患者的10份新鮮人體組織樣本進行了scRNA序列分析，包括三份原發(fā)腫瘤樣本（PT；即PT1、PT2和PT3）、一份相鄰的非腫瘤樣本（NT；即NT1）和六份轉(zhuǎn)移樣本（M）。在轉(zhuǎn)移樣本中，作者在胃鏡檢查、活檢或手術(shù)切除中獲得了兩個肝轉(zhuǎn)移樣本（Li：即Li1和Li2）、兩個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本（LN：即LN1和LN2）、一個腹膜轉(zhuǎn)移樣本（P：P1）和一個卵巢轉(zhuǎn)移樣本（O：O1）。其中，PT1和Li1來自患者1；PT2和NT1來自患者2；O1來自患者3；PT3、Li2和LN1來自患者4；LN2來自患者5；P1來自患者6。PT1、PT2、PT3、Li1、Li2、LN1和P1是腸道組織學(xué)GC樣品，而LN2和O1是組織混合型GC樣本。
在經(jīng)過質(zhì)量篩選后，作者共檢測到42968個細胞以用于下游分析（圖1A、B）。在進行降維和聚類以及運用Marker基因進行細胞注釋后共確定了七種細胞類型，分別為上皮細胞、基質(zhì)細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷細胞和髓系細胞等（圖1C）并展示了注釋每種細胞類型所運用到的Marker（圖1D、E）。作者對不同的細胞類型進行數(shù)目上的統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)由于不同細胞類型的分離效率不同，免疫細胞在所有樣本中所占比例最大（90.4%），尤其是淋巴結(jié)和肝臟。
最后作者對于原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤進行了分析，發(fā)現(xiàn)每種細胞的比例差異很大（圖1F），揭示了轉(zhuǎn)移性腫瘤與原發(fā)性腫瘤相比較腫瘤間的異質(zhì)性。
圖1：GC原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移灶和鄰近非腫瘤樣本的單細胞轉(zhuǎn)錄組譜
Result2:惡性上皮細胞的四個亞群特征與腫瘤轉(zhuǎn)移和生存時間的關(guān)系
作者借鑒之前發(fā)表在GUT文章上面的一個工作，通過計算每個惡性細胞中的腫瘤患者差異基因的表達豐度（score值）以此定義每個細胞的惡性程度。運用該方法作者共識別到1615個惡性細胞和128個非惡性上皮細胞。其中大部分的非惡性上皮細胞來自NT（圖2A）。此外，作者發(fā)現(xiàn)與非惡性上皮細胞相比，惡性上皮細胞中幾種腫瘤特異性基因（CLDN4、CLDN7、TFF3）的表達顯著上調(diào)，而非惡性上皮細胞強烈表達與胃粘液和消化酶分泌相關(guān)的幾個基因（MUC5AC、GKN1、PGC、LIPF），驗證了注釋細胞惡性程度的準確性。接著作者對PT和M樣本中惡性細胞進行聚類分析，共顯示了四個亞聚類G0-G3（圖2B），同時對不同樣本以及不同轉(zhuǎn)移瘤中檢測到惡性細胞的數(shù)目進行統(tǒng)計以展示惡性細胞的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性（圖2C）。接下來，作者進一步通過功能分析等定義每個惡性細胞亞群的潛在功能。
具體來說：作者發(fā)現(xiàn)血管生成的關(guān)鍵因子（VEGFA）在G0細胞中顯著上調(diào)（圖2D），運用IPA(Upon Ingenuity pathway analysis)分析，發(fā)現(xiàn)G0顯著富集于血管內(nèi)皮細胞的血管生成和粘附等信號通路（圖2E）。惡性細胞亞群G1特異性表達上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因SRGN、VIM和LAPTM5A，說明惡性細胞亞群G1具有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的功能（圖2E）。惡性細胞亞群G2主要存在于LN3和PT患者中（圖2C）。作者在進行IPA分析后發(fā)現(xiàn)G2細胞中的p53信號被激活，這將誘導(dǎo)細胞凋亡并抑制腫瘤生長。因此，G2細胞可能在GC患者中的呈現(xiàn)休眠狀態(tài)。惡性細胞亞群G3細胞主要見于PT和M樣本中。在G3細胞中，腫瘤惡性相關(guān)基因RASD1、PIK3R1、JUN和FOS顯著上調(diào)（圖2D），SPINK1癌癥途徑和HGF信號通路被激活，表明G3促進GC的惡性進展。生長因子途徑對EMT的調(diào)節(jié)也顯著增強（圖2D），且E M T相關(guān)基因（ZEB2、VIM和ID2）顯著上調(diào)，表明G3細胞中誘導(dǎo)了EMT進展。同時作者發(fā)現(xiàn)與惡性上皮細胞的其他亞群相比，G3中CD44（圖2F）、PROM1（CD133）、LGR5等癌干細胞（CSCs）標(biāo)記物的表達也顯著上調(diào)，說明腫瘤干細胞在癌細胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。
之后，作者運用Monocle進行細胞擬時序分析，可以看出惡性上皮細胞的動態(tài)特征和異質(zhì)性（圖2G）。具體而言，在最初階段作者觀察到具有EMT誘導(dǎo)的CSC表型的G3細胞，隨后是G1細胞。休眠樣細胞G2和促血管生成G0細胞位于不同的軌跡分支，意味著惡性細胞進入了不同的分化狀態(tài)。
最后作者進一步使用來自TCGA胃腺癌數(shù)據(jù)集，進行惡性細胞亞群特征基因的生存分析：我們發(fā)現(xiàn)高表達G0、G1、G3特征基因的患者預(yù)后較差(圖2H-J)。
圖2：胃癌中惡性上皮細胞的四個亞群及其與轉(zhuǎn)移相關(guān)的特征
Result3: 細胞T和B細胞在GC進展過程中介導(dǎo)各種免疫反應(yīng)
作者通過細胞Marker基因注釋后共獲得24 448個T細胞，進一步降維聚類獲得11個亞群。其中包括5個CD8+亞群、5個CD4+亞群和1個未知亞群(圖3A、3B)。
CD4+亞群由naive CD4+ T細胞，調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)，耗竭CD4+ T細胞，效應(yīng)記憶CD4+ T細胞(CD4+ TEM)和GADD45B+ Th1 CD4+ T細胞組成。CD8+亞群由naive CD8+ T細胞，細胞毒性CD8+ T細胞(GNLY, GZMB)，耗竭CD8+ T細胞，效應(yīng)記憶CD8+ T細胞和mucosal-associated invariant T細胞 (MAIT)組成（圖3A）。
如圖3B所示，腫瘤樣本(PT和M)中CD4+ T細胞和treg細胞的耗散程度較高，而M中CD4+ TEM、CD8+ TEM和細胞毒性CD8+ T細胞的比例與NT相比如預(yù)期的略有降低，表明腫瘤進展和轉(zhuǎn)移過程中產(chǎn)生了免疫抑制情況。此外作者通過比較不同種類的樣本中的MAIT細胞比例，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移樣本（M）中，MAIT細胞不表達GZMB（編碼一種可以殺死感染細胞的蛋白質(zhì)）但高表達KLRG1（T細胞功能失調(diào)相關(guān)的基因）(圖3C)，與生物學(xué)先驗知識背景相呼應(yīng)。免疫熒光染色顯示，在PT和M中均可觀察到MAIT細胞，在M中數(shù)量較多(圖3D)。
為了識別T細胞亞群的特征并分析他們之間的關(guān)聯(lián)，作者進一步進行了細胞通訊的分析，檢測細胞毒性/耗竭性CD8+ T細胞和NK細胞中KLRC1/KLRC2的表達水平：作者發(fā)現(xiàn)在腫瘤內(nèi)CD8+ T細胞和NK細胞中KLRC1表達均上調(diào)，同時細胞通訊分析還預(yù)測了每個患者不同細胞類型中HLA-E-KLRC1/KLRC2受配體的表達豐度 (圖3E)。作者進一步將不同患者的CD8+ T細胞中的PDCD1表達與檢查點阻斷治療進行關(guān)聯(lián)分析，以此推斷TIGIT和LAG3為患者1，2，5，6的共抑制受體(圖3F)。接著，作者對7708個B細胞進行細胞亞群的注釋，共注釋為5個B細胞亞群（圖3G），不同樣本中B細胞類型的比例差異很大（圖3H），表明胃原發(fā)腫瘤和不同轉(zhuǎn)移灶中腫瘤微環(huán)境中的免疫異質(zhì)性問題。最后在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)了一種細胞類型并命名為T細胞樣B細胞（T cell like-B cell），在M中表達最高，T cell like-B cell相關(guān)DEGs的通路分析顯示，白細胞/淋巴細胞的結(jié)合和NK細胞/淋巴細胞的細胞毒性顯著增強，說明T cell like-B cell與其他細胞亞型的相互作用(圖3I)。
圖3：GC進展過程中由T和B細胞介導(dǎo)的各種免疫反應(yīng)。
Result4：內(nèi)皮細胞促進血管生成并產(chǎn)生免疫抵抗
在本研究中，399個細胞被鑒定為內(nèi)皮細胞，其典型標(biāo)記基因表達一致。對其降維聚類后共分為4個亞型，分別為E0-E3(圖4A)。其中E0細胞在PT和M中特異性表達IGFBP5、STC1和IGFBP3，而在NT中不表達IGFBP3(圖4B)。促血管生成因子VEGFA和TGF-β是IGFBP5的上游調(diào)控因子。IPA顯示，與胃癌中腫瘤侵襲密切相關(guān)的mTOR和IGF-1信號在E0細胞中均被正調(diào)控，因此作者定義E0細胞亞群可能增加腫瘤細胞的侵襲和遷移(圖4C和D)。同時，IPA還顯示E1細胞與T細胞衰竭信號通路的調(diào)節(jié)密切相關(guān)(圖4D)。E2細胞在NT細胞中占比最高(88%)，其活性低于其他三個亞群，在本文章定義為正常內(nèi)皮細胞(圖4C和D)。E3細胞中白色脂肪組織褐變通路被激活，其中VEGF受體編碼基因NRP1和成纖維細胞生長因子受體編碼基因FGFR1表達顯著上調(diào)(圖4D)，因此定義E3細胞亞群為參與血管生成的細胞亞群。最后作者又運用TCGA胃癌的隊列數(shù)據(jù)進行驗證，進一步說明高表達E1和E3細胞亞群特征的患者的預(yù)后較差(圖4F)。
圖4：內(nèi)皮細胞促進GC血管生成并產(chǎn)生免疫抵抗
Result5：炎性癌成纖維細胞(iCAFs)與GC生長和侵襲有關(guān)
作者將889個成纖維細胞無監(jiān)督聚類為兩個不同的亞型(圖5A-5C)。其中F0（高表達PDGFRA和CXCL12）是主要的成纖維細胞類型，在PT和M占比較高(圖5D)：高度表達RGS5和ACTA2，類似于膀胱尿路上皮癌中描述的iCAFs。F1細胞 (圖5D)被鑒定為肌癌相關(guān)成纖維細胞(mCAFs)。與F0類似，F(xiàn)1細胞在不同樣品中的比例差異較大(圖5B)。作者通過GO進行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)iCAF和mCAF均富集于細胞外基質(zhì)和細胞-底物粘附富集這一功能；但mCAFs特異性富集于肌肉相關(guān)過程；而iCAF則富集于細胞外基質(zhì)分解、白細胞遷移調(diào)節(jié)、以及細胞生長和血管生成的調(diào)節(jié)(圖5E)。MMP2和MMP14被認為促進細胞外基質(zhì)降解和腫瘤細胞侵襲的基因，這兩個基因主要在iCAFs中表達，影響top富集的生物功能(圖5F)，并能促進細胞外基質(zhì)降解和腫瘤細胞侵襲。CXCL12也是iCAFs中的特異性標(biāo)記物(圖5D)，其在CAFs中的高表達可促進GC細胞侵襲和EMT。為了確認iCAFs是否能調(diào)節(jié)細胞生長和血管生成，作者進一步分析了iCAFs和mCAFs中各種生長因子編碼基因(VEGF、IGF、FGF家族)的表達 (圖5G)，提示iCAFs可以促進GC腫瘤生長。最后通過細胞通訊分析(圖5I)，配體-受體對CXCL12-CXCR4參與了iCAFs與T、B或髓系細胞之間的相互作用，經(jīng)過文獻證實這是GC中免疫抵抗的一種機制。最后，作者將iCAF與生存進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)與低表達患者相比，高表達iCAF特征基因的患者患者的總體生存率更差（p<0.05），進一步驗證了iCAF與細胞生長和血管生成相關(guān)這一結(jié)論。(圖5H)
圖5：CAF可在GC的TME中識別，并與腫瘤侵襲相關(guān)。
Result 6: GC中髓細胞譜系的多樣性
作者通過無監(jiān)督聚類和細胞marker基因的注釋，共確定了1801個單核吞噬細胞系統(tǒng)細胞（326個樹突狀細胞（DC）、894個巨噬細胞和581個單細胞）、139個肥大細胞和3579個中性粒細胞（圖6A）。作者進一步對每種細胞亞群又進行了細分，其中樹突狀細胞DC被重新分類為經(jīng)典DC1（cDC1）、經(jīng)典DC2（cDC2）、漿細胞樣DC（pDCs）和活化DC，經(jīng)過分類別的數(shù)量統(tǒng)計，cDC1和cDC2在PT和M中富集，而NT中活化DC的比例較大（圖6B）。有趣的是，在NT中很少發(fā)現(xiàn)pDC，但在LN和一些PT中出現(xiàn)，分析原因為pDC高度表達顆粒酶基因GZMB和白細胞免疫球蛋白樣受體家族基因LILRA4和LILRB4，低表達CD86、CD80、CD83和LAMP3等基因，因此顯示出免疫抑制表型（圖6C）。
作者對Ma0-Ma3四個巨噬細胞亞群計算之前較為常見的M0和M1打分，進一步對巨噬細胞進行了詳細的劃分(圖6D和E)。Ma0聚集在PT中，高表達的誘導(dǎo)血管生成和癌細胞遷移的重要巨噬細胞基因VEGFA和SPARC(圖6F)，說明Ma0可能是一種與血管生成相關(guān)的巨噬細胞類型。Ma1細胞表達的DEGs包括HLA-DPB1和HLA-DPA1 (MHC-II)(圖6F)，它們與促炎表型相關(guān)。Ma2中FABP5高表達顯示其與免疫抑制密切相關(guān)。
單核細胞分為兩種已知類型，CD14+CD16（FCGR3A）? 經(jīng)典單核細胞亞型Mo1和Mo3和CD14+CD16+細胞亞型Mo0和Mo2(圖6G-I)。PT含有大量Mo0、Mo1和Mo3單核細胞。相反，M特別是O和Li在Mo2細胞中富集（圖6H）。IPA顯示Mo2細胞具有增強腫瘤細胞吞噬和細胞死亡的功能，因此，Mo2細胞可能對腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒性作用。
中性粒細胞亞簇顯示六個簇（圖6J和K）。其中LYZ編碼的溶菌酶是Paneth細胞分泌的一種抗菌肽，與自噬和維持免疫穩(wěn)態(tài)有關(guān)。作者同時進行了IPA分析，富集結(jié)果顯示N0細胞吞噬功能增強（圖6L），并進行實驗驗證，通過RNAscope和標(biāo)記基因LYZ和NAMPT進一步證實了GC中存在Paneth樣細胞（圖6M）。同時作者對髓源性抑制細胞（MDSC）進行了進一步亞型的劃分，進一步刻畫了胃癌患者腫瘤異質(zhì)性的問題。
圖6：GC進展期髓樣細胞的富集情況
Result 7:淋巴結(jié)源性耗竭性CD8+T細胞的20個基因特征被證實可以預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移
腫瘤浸潤性T細胞和B淋巴細胞在癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用；了解這些免疫細胞在不同器官GC轉(zhuǎn)移中的浸潤狀態(tài)，可以為器官特異性轉(zhuǎn)移制定特定的診斷和治療策略。作者采用無監(jiān)督方法對T細胞和B淋巴細胞的每個亞群進行重新聚類，探討GC中淋巴細胞的器官特異性轉(zhuǎn)移特征。如圖7A TSNE降維結(jié)果所示，在大多數(shù)T細胞亞群和一些B細胞亞群中，不同的器官轉(zhuǎn)移在轉(zhuǎn)錄上是異質(zhì)的（每一種疾病樣本類型中包含不同的亞型）。
早期GC中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率極高，在單細胞分辨率下識別淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特征具有重要意義。因此，作者通過差異分析，識別了20個（top 20）GC中生成淋巴結(jié)衍生（lymph node-derived）T細胞和B細胞亞群的基因表達特征并為每個淋巴結(jié)衍生的T細胞和B細胞亞群添加了20個基因標(biāo)簽。如圖7B所示，在耗竭性CD8+T細胞中，淋巴結(jié)衍生亞群中前20個上調(diào)的DEG在LN中的表達高于其他轉(zhuǎn)移瘤，同時與其他原發(fā)腫瘤相比，PT3（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的原發(fā)腫瘤樣本）中的表達也更高，表明20個基因特征可以反映從原發(fā)部位向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的模式；作者進一步將20個signature與患者的預(yù)后進行關(guān)聯(lián)，說明了這20個signature對于患者生存時間的影響（圖7D）。
圖7：不同器官轉(zhuǎn)移的T和B淋巴細胞亞群異質(zhì)性探究
自此這篇文章的主題內(nèi)容就介紹完畢啦，總體來說，作者對胃癌特異性器官轉(zhuǎn)移的6名患者進行了單細胞RNA-seq測序，通過對腫瘤微環(huán)境中每種細胞類型的刻畫，識別了胃癌患者中，原發(fā)腫瘤和器官轉(zhuǎn)移的異質(zhì)性問題，結(jié)合TCGA組學(xué)數(shù)據(jù)進一步進行了驗證；最終識別到了可以作為胃癌特異性性器官轉(zhuǎn)移的腫瘤浸潤性T細胞和B淋巴細胞的signatures。整體的文章思路清晰，尤其是在GC腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的刻畫上細致入微，可見，數(shù)據(jù)量并不是發(fā)好文章的唯一法寶，與生物學(xué)意義緊密結(jié)合，也同樣可以盡顯工作的意義。
