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腫瘤免疫微環(huán)境包含T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞、髓系細(xì)胞等多種腫瘤浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞，這些免疫細(xì)胞一方面抑制、殺傷腫瘤細(xì)胞起著抗腫瘤免疫作用，另一方面又起著促進(jìn)腫瘤發(fā)展及免疫逃逸作用。因此，在當(dāng)前腫瘤研究中，腫瘤免疫微環(huán)境已成為重要的關(guān)注點(diǎn)。然而，傳統(tǒng)基因測(cè)序方法只能捕獲組織樣本中不同種類細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)信息平均后的結(jié)果，使得分析不能有效識(shí)別和刻畫(huà)腫瘤微環(huán)境中各個(gè)免疫細(xì)胞的種類及其所處狀態(tài)，同時(shí)也可能掩蓋了許多關(guān)鍵的信息。因此，近年來(lái)單細(xì)胞測(cè)序在腫瘤研究中越來(lái)越受到重視，這是由于單細(xì)胞具有更高的分辨率，有助于闡明腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥和免疫逃逸等分子作用機(jī)制，從而使實(shí)體瘤的臨床診治和預(yù)測(cè)變得更加準(zhǔn)確。
生信人也一直在持續(xù)關(guān)注有關(guān)單細(xì)胞研究的文章，推出了多個(gè)單細(xì)胞相關(guān)的研究思路及角度。今天小編就再和大家分享一個(gè)值得學(xué)習(xí)的單細(xì)胞分析思路——單細(xì)胞與組織相結(jié)合：研究中如果將單細(xì)胞水平和組織水平的基因表達(dá)特征結(jié)合起來(lái)，通常能夠起到互相補(bǔ)充互相驗(yàn)證的效果，不僅可以豐富我們的研究?jī)?nèi)容，還可以使生信結(jié)果更加可靠，使研究結(jié)論更有深度。因此，在這里小編為大家介紹一篇今年4月剛發(fā)表在Journal of Advanced Research（IF:12.822）雜志上的關(guān)于卵巢癌（ovarian cancer ;OV）免疫與預(yù)后的文章，這是一篇比較典范的單細(xì)胞與組織測(cè)序數(shù)據(jù)整合分析的文章，文章從組織入手發(fā)現(xiàn)現(xiàn)象后轉(zhuǎn)到單細(xì)胞解析后又切回組織分析，其中用到的都是比較基礎(chǔ)的生信方法，簡(jiǎn)單易懂，而且用到的也都是公共數(shù)據(jù)，但最終卻發(fā)到了12+，可見(jiàn)組織與單細(xì)胞整合可謂雙劍合璧，常常起到一加一大于二的效果。長(zhǎng)話短說(shuō)，接下來(lái)就讓小編和大家分享下這篇文章的主要內(nèi)容，一睹為快吧。
Integrated immunogenomic analysis of single-cell and bulk tissue transcriptome profiling unravels a macrophage activation paradigm associated with immunologically and clinically distinct behaviors in ovarian cancer
整合單細(xì)胞和組織轉(zhuǎn)錄組的免疫基因組分析揭示卵巢癌中與免疫和臨床差異行為相關(guān)的巨噬細(xì)胞激活模式
一． 研究背景
卵巢癌(OV)是婦科癌癥相關(guān)死亡的最常見(jiàn)原因，具有高發(fā)病率和死亡率。其中大多數(shù)OV患者在診斷時(shí)已處于晚期。盡管OV患者可用手術(shù)和化療等治療方案，但多數(shù)患者仍會(huì)在化療后復(fù)發(fā)，且OV復(fù)發(fā)患者的中位生存期常常低于2年，并且由于缺乏能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)化療應(yīng)答的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，其臨床結(jié)局仍不盡人意。而目前越來(lái)越多的證據(jù)表明，巨噬細(xì)胞亞型的激活狀態(tài)和不同譜系在腫瘤微環(huán)境中呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)異質(zhì)性，在多種癌癥類型中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此，這篇文章就重點(diǎn)關(guān)注了不同亞型巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性、內(nèi)穩(wěn)態(tài)對(duì)卵巢癌生物學(xué)和臨床結(jié)局等的影響。
二． 摘要
文章對(duì)單細(xì)胞和組織轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了整合免疫基因組分析，系統(tǒng)地研究了巨噬細(xì)胞活化與預(yù)后和治療療效之間的關(guān)系。文章主要采用一致性聚類分析識(shí)別出了新的巨噬細(xì)胞亞型，并利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬巨噬細(xì)胞的動(dòng)態(tài)激活。最終在泛隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)M0和M1巨噬細(xì)胞相對(duì)浸潤(rùn)豐度高與預(yù)后和療效改善相關(guān)，而M2巨噬細(xì)胞則相反。研究也觀察到無(wú)監(jiān)督一致性聚類分析識(shí)別出的兩個(gè)OV亞群具有不同的臨床和免疫行為。最后，作者提出了一個(gè)巨噬細(xì)胞極化衍生的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，其能夠作為一個(gè)強(qiáng)大的預(yù)后因子和治療療效的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物，該模型在不同的獨(dú)立患者隊(duì)列中都得到了驗(yàn)證。這篇文章刻畫(huà)了巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性并解析了其與OV預(yù)后的關(guān)系，同時(shí)強(qiáng)調(diào)了巨噬細(xì)胞激活模型在預(yù)防和治療腫瘤方面的臨床潛力。
三． 數(shù)據(jù)及方法
1. 數(shù)據(jù)：作者從GEO、TCGA、ArrayExpress 數(shù)據(jù)庫(kù)及PubMed發(fā)表的文獻(xiàn)中獲取了OV患者的腫瘤組織RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床信息。在排除無(wú)生存數(shù)據(jù)或化療反應(yīng)信息的隊(duì)列后，該研究最終納入了26個(gè)隊(duì)列的2791個(gè)OV樣本。同時(shí)研究從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了5個(gè)獨(dú)立的OV標(biāo)本的167690個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)數(shù)據(jù)和臨床信息，這五個(gè)樣本中兩個(gè)是化療耐藥患者，一個(gè)是化療難治性患者，其余兩個(gè)是化療敏感患者。此外，研究也收集了一些發(fā)表文獻(xiàn)的腫瘤組織RNA-seq數(shù)據(jù)和患者接受免疫阻斷治療的臨床信息。
2. 數(shù)據(jù)處理和質(zhì)控：作者使用Robust Multiarray Average算法對(duì)Affymetrix HG-U133A和HGU133_Plus_2平臺(tái)的原始芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，其他平臺(tái)的處理和標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)由相應(yīng)作者或數(shù)據(jù)庫(kù)提供。研究中scRNA-seq數(shù)據(jù)使用R包Seurat 進(jìn)行質(zhì)量控制和下游分析，利用其中的整合函數(shù)將5個(gè)樣本整合到一個(gè)Seurat對(duì)象中。質(zhì)控過(guò)程中排除表達(dá)基因小于200個(gè)、獨(dú)特分子標(biāo)識(shí)符(UMIs) 大于20,000和線粒體來(lái)源UMI計(jì)數(shù)大于10%的低質(zhì)量細(xì)胞。最終有43057個(gè)細(xì)胞用作下游分析。接著作者使用Seurat中的SCTransform函數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)處理。并使用包DoubletFinder識(shí)別和刪除雙重事件細(xì)胞，最終留下40218個(gè)細(xì)胞后續(xù)分析。
3. 推斷腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞豐度：作者為了評(píng)估免疫微環(huán)境中特異細(xì)胞成分的分布，利用CIBERSORT測(cè)定了22種免疫細(xì)胞類型的相對(duì)比例。為了避免多個(gè)隊(duì)列之間的偏性，作者在每個(gè)隊(duì)列中分別確定了22種免疫細(xì)胞類型的相對(duì)比例，然后匯集起來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步分析。
4. 一致性聚類:文章采用基于Pearson相關(guān)系數(shù)的K-means聚類方法進(jìn)行一致性聚類，使用R包ConsensusClusterPlus 執(zhí)行基于歐氏距離度量的聚類方法。
5. 單樣本基因集富集分析：作者從先前研究中獲取免疫調(diào)節(jié)基因，并從Molecular Signatures Database數(shù)據(jù)庫(kù)獲取hallmark基因集。每個(gè)樣本的免疫調(diào)節(jié)基因集或hallmark基因集的富集評(píng)分用 ssGSEA與GSVA進(jìn)行計(jì)算。
6. 巨噬細(xì)胞極化衍生人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型(MacroANN)的建立：神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是基于輸入層、隱藏層和輸出層的機(jī)器學(xué)習(xí)模型。它是一種廣泛應(yīng)用于高維數(shù)據(jù)回歸分析和分類的方法。作者為了捕獲和量化巨噬細(xì)胞亞型的浸潤(rùn)模式，使用nnet包將各亞型巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度轉(zhuǎn)化為前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。然后，開(kāi)發(fā)了一個(gè)機(jī)器學(xué)習(xí)模型MacroANN，能夠使用一個(gè)基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的分類器區(qū)分UnPol和M2Pol功能狀態(tài)。樣本被隨機(jī)分為訓(xùn)練隊(duì)列和測(cè)試隊(duì)列。作者預(yù)測(cè)了測(cè)試隊(duì)列，并記錄了預(yù)后及化療應(yīng)答的差異。該分類器也被應(yīng)用于免疫治療隊(duì)列，以區(qū)分可能受益于治療的患者和可能不受益于治療的患者。
四． 主要內(nèi)容及結(jié)果
1. 公開(kāi)OV數(shù)據(jù)集的免疫基因組特征揭示了巨噬細(xì)胞在OV預(yù)后和化療中的關(guān)鍵作用
在文章的第一部分，作者首先定量估計(jì)了腫瘤微環(huán)境（TME）中免疫浸潤(rùn)的細(xì)胞組成，并利用單因素Cox回歸分析評(píng)估了18個(gè)公開(kāi)的OV隊(duì)列中每種免疫細(xì)胞類型的預(yù)后影響。然后利用18個(gè)OV隊(duì)列進(jìn)行meta分析，對(duì)每種免疫細(xì)胞類型進(jìn)行總體預(yù)后評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn):na?ve CD4 T細(xì)胞、靜息CD4記憶T細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)與預(yù)后不良相關(guān)。而活化CD4記憶T細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與改善預(yù)后相關(guān)(圖1A)。生存分析顯示，na?ve CD4 T細(xì)胞、靜息記憶CD4 T細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞或嗜酸性粒細(xì)胞低浸潤(rùn)患者的OS明顯高于高浸潤(rùn)患者，而活化CD4記憶T細(xì)胞、M0和M1型巨噬細(xì)胞低浸潤(rùn)患者的OS明顯短于高浸潤(rùn)患者(圖1B)。接下來(lái)，作者在11個(gè)有化療信息的公開(kāi)OV隊(duì)列中進(jìn)一步研究了每種免疫細(xì)胞類型與化療應(yīng)答之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)化療敏感組和化療耐藥組的9種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度有顯著差異(圖1C)?；熋舾薪M的記憶B細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、活化樹(shù)突狀細(xì)胞明顯富集。相比之下，化療耐藥患者na?ve B細(xì)胞、靜息NK細(xì)胞和靜息CD4記憶T細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度增加。為了進(jìn)一步驗(yàn)證OV中巨噬細(xì)胞的臨床意義，作者對(duì)17例OV患者(10例復(fù)發(fā)和7例不復(fù)發(fā)患者)進(jìn)行了M1和M2巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD86和CD206的免疫組化檢測(cè)。結(jié)果如圖1D所示，CD86在非復(fù)發(fā)患者組織中的表達(dá)水平顯著高于復(fù)發(fā)患者，而CD206在非復(fù)發(fā)患者組織中的表達(dá)水平顯著低于復(fù)發(fā)患者。這些結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞與OV的預(yù)后和治療效果有關(guān)。
2. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析證實(shí)了巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)與化療反應(yīng)之間的聯(lián)系
在文章的第二部分作者對(duì)5例OV患者的scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。作者共分析了40218個(gè)細(xì)胞，其中31358個(gè)細(xì)胞來(lái)自化療耐藥患者，8860個(gè)單細(xì)胞來(lái)自敏感患者。作者在這些細(xì)胞中識(shí)別了四種免疫細(xì)胞類型，包括T或自然殺傷(NK)細(xì)胞、B細(xì)胞、髓樣細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞，以及四種非免疫細(xì)胞類型(圖2A)。分析發(fā)現(xiàn)化療耐藥樣本在成纖維細(xì)胞、髓樣細(xì)胞和上皮細(xì)胞中高度富集，而B(niǎo)和T或NK細(xì)胞在化療敏感樣本中富集(圖2B)。隨后髓系細(xì)胞被進(jìn)一步分為5個(gè)巨噬細(xì)胞亞群，2個(gè)髓系樹(shù)突狀細(xì)胞亞群和1個(gè)單核細(xì)胞亞群(圖2C)。作者發(fā)現(xiàn)Macro-C1特異性表達(dá)趨化因子基因 CCL3、CCL4和CCL5，并顯示M1和M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物共表達(dá)(圖2C和D)，而Macro-C3中FTL表達(dá)水平升高，Macro-C4高表達(dá)SPP1，Macro-C5則高表達(dá)M0巨噬細(xì)胞標(biāo)志物。此外，Macro-C5表達(dá)高水平的促炎細(xì)胞因子和趨化因子(圖2D)，表示M1表型極化。這些結(jié)果表明，Macro-C2、-C3和-C4對(duì)應(yīng)M2樣巨噬細(xì)胞，Macro-C5對(duì)應(yīng)M1樣巨噬細(xì)胞。此外，作者也觀察到巨噬細(xì)胞亞群分布的差異，M2樣巨噬細(xì)胞在化療耐藥患者中占主導(dǎo)，而來(lái)自化療敏感患者的樣本則富含Macro-C5(圖2E)。隨后作者對(duì)化療耐藥和化療敏感樣本的巨噬細(xì)胞亞群進(jìn)行分級(jí)聚類和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)具有不同的表達(dá)模式(圖2F)。化療耐藥組的巨噬細(xì)胞亞群表達(dá)的基因涉及多種疾病相關(guān)通路(如脂質(zhì)、動(dòng)脈粥樣硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等)。相比之下，來(lái)自化療敏感組的巨噬細(xì)胞亞群在免疫和抗腫瘤相關(guān)通路(IL-17信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路)中富集。因此，可見(jiàn)scRNA-seq分析支持了組織轉(zhuǎn)錄組的發(fā)現(xiàn)，并表明巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)與化療反應(yīng)性相關(guān)。
3. 巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)確定了臨床不同的患者亞群
在文章的第三部分，作者探討了不同亞型巨噬細(xì)胞的相對(duì)浸潤(rùn)豐度與患者預(yù)后的關(guān)系。根據(jù)M0、M1和M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)豐度的中位值將2791個(gè)OV樣本分為8類(圖3A)。作者觀察到8組間OS有顯著差異。與其他組相比，M0hiM1hiM2lo組患者的OS更高(圖3B)。此外，作者還分析了巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)總體應(yīng)答的影響。結(jié)果顯示，M0hiM1hiM2lo組患者的化療應(yīng)答率最高，而M0loM1loM2hi組患者的化療應(yīng)答率最低(圖3C)。接下來(lái)，作者通過(guò)無(wú)監(jiān)督一致性聚類分析，確定了兩個(gè)具有不同功能狀態(tài)的患者亞組(圖3D)，其中組1（UnPol亞型）的特征是M0和M1巨噬細(xì)胞的豐度高，而組2（M2Pol）則顯示M2巨噬細(xì)胞的豐度高和M0及M1巨噬細(xì)胞的豐度相對(duì)低。生存分析顯示，UnPol亞型與OS改善相關(guān)（圖3E)。作者還注意到，UnPol亞型與M2Pol亞型在化療應(yīng)答方面顯著不同(圖3F)。此外，作者也發(fā)現(xiàn)TCGA定義的分子亞型幾乎可以平均分為UnPol和M2Pol亞型，這表明了這兩種亞型的實(shí)用性(圖3G)。此外，也發(fā)現(xiàn)這種以巨噬細(xì)胞為基礎(chǔ)的亞型分類通過(guò)多變量Cox回歸分析調(diào)整其他臨床特征后仍與OS保持著顯著的相關(guān)性(圖3H)。綜上所述，這些結(jié)果表明TME中的巨噬細(xì)胞極化顯著影響OV患者的臨床結(jié)局。
4. 巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)在免疫上區(qū)分不同的亞群
在這一部分作者進(jìn)一步探索了可能導(dǎo)致亞組免疫行為差異的巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)。首先，作者從Vidotto等人的研究中獲得了包括63個(gè)免疫調(diào)節(jié)基因的基因集，其中包括免疫激活因子和抑制因子，然后計(jì)算了ssGSEA評(píng)分來(lái)評(píng)估免疫激活或抑制程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)如圖4A所示，M2Pol亞型比UnPol亞型表現(xiàn)出更高的免疫激活和免疫抑制，這表明兩種亞型之間可能存在不同的促進(jìn)腫瘤免疫逃逸的機(jī)制。此外，作者分析了免疫檢查點(diǎn)分子的平均表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)M2Pol亞型比UnPol亞型表達(dá)更高(圖4B)。同時(shí)觀察到主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類和II類以及非經(jīng)典的MHC分子(抗原呈遞分子)在M2Pol亞型中也上調(diào)(圖4B)。作者還分析了化療耐藥和敏感患者的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中MHC和免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)水平，結(jié)果觀察到，與敏感患者相比，耐藥患者巨噬細(xì)胞中MHC和免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)水平明顯更高(圖4C)。這些結(jié)果表明M2Pol亞型腫瘤表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子逃避免疫監(jiān)測(cè)。作者進(jìn)一步檢測(cè)UnPol和M2Pol亞組中促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)促炎細(xì)胞因子優(yōu)先表達(dá)于UnPol亞型，而抗炎細(xì)胞因子主要表達(dá)于M2Pol亞型(圖4D)，且腫瘤中巨噬細(xì)胞的趨化因子在不同狀態(tài)下表達(dá)不同(圖4D)，同時(shí)M2Pol亞型中腫瘤抑制因子CCL14表達(dá)上調(diào)。相比之下，促炎趨化因子CXCL5和CXCL1在UnPol亞型中表達(dá)上調(diào)。接著作者比較了UnPol亞型和M2Pol亞型在TME中不同免疫細(xì)胞亞群的分布和相對(duì)豐度，結(jié)果如圖4E所示，可以觀察到免疫抑制細(xì)胞亞群在M2Pol中富集，提示免疫抑制細(xì)胞的增加可能有助于M2Pol亞型的免疫逃逸。為了進(jìn)一步研究UnPol和M2Pol亞型腫瘤是否具有不同的生物學(xué)特征，作者計(jì)算了每個(gè)樣本的hallmark基因集的ssGSEA得分，并識(shí)別了參與細(xì)胞周期、炎癥、免疫反應(yīng)和細(xì)胞代謝的差異表達(dá)基因模塊(圖4F)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)UnPol亞型具有細(xì)胞周期通路高激活的特點(diǎn)，而M2Pol亞型具有較高的炎癥或免疫反應(yīng)。作者也觀察到氧化磷酸化和糖酵解標(biāo)志基因集分別在M2Pol亞型和UnPol亞型中富集。
5. MacroANN預(yù)測(cè)患者的預(yù)后和治療效果
在文章的最后一部分，作者在訓(xùn)練隊(duì)列中開(kāi)發(fā)了巨噬細(xì)胞極化衍生的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型(簡(jiǎn)稱MacroANN)，來(lái)預(yù)測(cè)臨床結(jié)果和治療療效(圖5A)。當(dāng)應(yīng)用于試驗(yàn)隊(duì)列時(shí)，可以觀察到MacroANN能夠區(qū)分患者化療受益(圖5B)，且受益組患者的生存時(shí)間明顯優(yōu)于無(wú)受益組。接著作者為了進(jìn)一步測(cè)試MacroANN是否為免疫治療應(yīng)答提供了額外的預(yù)測(cè)價(jià)值，作者將MacroANN應(yīng)用于三個(gè)免疫治療隊(duì)列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該模型準(zhǔn)確預(yù)測(cè)了臨床療效，并將患者分為療效組和無(wú)效組。與無(wú)獲益組相比，預(yù)期獲益組患者的應(yīng)答率更高，且在Van Allen、Hugo和Gide組中，受益組患者的緩解率均高于無(wú)獲益組患者相應(yīng)的緩解率(圖5C)。此外，生存分析結(jié)果表明，預(yù)測(cè)的受益擬合組與OS改善顯著相關(guān)(圖5D)。這些結(jié)果表明，MacroANN可以預(yù)測(cè)臨床結(jié)局，以及對(duì)化療和免疫治療的應(yīng)答。
到這里，這篇文章的主要內(nèi)容就介紹完了。文章將單細(xì)胞與組織相結(jié)合，重點(diǎn)關(guān)注了卵巢癌中巨噬細(xì)胞對(duì)臨床結(jié)局，化療及免疫治療的影響。文章收集了多個(gè)平臺(tái)的數(shù)據(jù)，內(nèi)容充實(shí)，方法簡(jiǎn)潔，邏輯清晰。小編讀完感覺(jué)文章這種從組織數(shù)據(jù)入手探索免疫微環(huán)境，轉(zhuǎn)到單細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證互補(bǔ)，最終回到組織指導(dǎo)分型及預(yù)測(cè)臨床結(jié)局的思路是文章的一大亮點(diǎn)。無(wú)論是主要關(guān)注組織還是重點(diǎn)研究單細(xì)胞的小伙伴都可以借鑒一下這個(gè)思路，畢竟單細(xì)胞與組織相輔相成，能夠幫助我們從多個(gè)維度更好的研究自己的課題。
