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乳腺癌是威脅女性生命安全最高的惡性腫瘤之一，而且盡管相關的治療方法日趨先進和完善，但遠期生存率仍不理想，且乳腺癌容易向身體的其他區(qū)域轉(zhuǎn)移。因此乳腺癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移是延長生存期的主要障礙。小編今天就和大家分享一篇今年七月剛剛發(fā)表在Nature（IF:69.504）雜志上的高分文章。文章對睡眠與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關系進行了研究，并進行了大量實驗同時結(jié)合生信分析從多個角度證明了睡眠對乳腺癌轉(zhuǎn)移有推動作用，文章的研究角度新穎、邏輯清晰很有啟發(fā)作用，長話短說，現(xiàn)在小編就帶大家一睹為快。
The metastatic spread of breast cancer accelerates during sleep
睡眠時乳腺癌的轉(zhuǎn)移擴散加速
一．研究背景
已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)在包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥類型中，循環(huán)腫瘤細胞(CTC)都是轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應的先驅(qū)。然而，目前生理情況下調(diào)節(jié)CTC自發(fā)性內(nèi)滲的因素尚不清楚，一般假設CTC是由浸潤性癌組織不斷生成，或者由機械信號(如手術)促進生成。此外，在患者和小鼠癌癥模型中，對癌癥轉(zhuǎn)移進展事件的確切時間，以及決定CTC轉(zhuǎn)移傾向的機制尚不清楚。因此，更好地了解這些過程可能會進一步促進癌癥的研究和治療。
二．文章摘要
該研究對乳腺癌患者和小鼠模型中CTC生成的動態(tài)模式進行了觀察，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)自發(fā)的CTC內(nèi)滲事件發(fā)生在睡眠期間。此外，該研究證明了靜息期的CTC很容易轉(zhuǎn)移，而活躍期產(chǎn)生的CTC則缺乏轉(zhuǎn)移能力。在機制上，CTC的單細胞RNA測序分析顯示，在患者和小鼠模型中，有絲分裂基因僅在靜息期顯著上調(diào)，從而使轉(zhuǎn)移能力更強。研究也發(fā)現(xiàn)關鍵的晝夜節(jié)律激素(如褪黑素、睪酮和糖皮質(zhì)激素)對CTC生成動力學起決定作用，且胰島素直接促進體內(nèi)腫瘤細胞增殖，但具有時間依賴性。因此，研究認為自發(fā)產(chǎn)生的具有高轉(zhuǎn)移傾向的CTC并非持續(xù)發(fā)生，而是集中在患者的休息階段。
三．實驗及方法
1. 患者樣本及細胞培養(yǎng)：研究納入了乳腺癌患者休息和活動階段的外周血樣本。研究培養(yǎng)了從1例性激素受體陽性乳腺癌患者制備的BR16細胞的CTC。研究也培養(yǎng)了人乳腺癌細胞MDA-MB-231 LM2，E0771.lmb小鼠乳腺癌細胞和4T1小鼠乳腺癌細胞(ATCC)。研究后續(xù)使用攜帶GFP -熒光素酶或mCherry -熒光素酶的慢病毒轉(zhuǎn)染LM2、BR16和4T1細胞，用攜帶CD90.1的慢病毒轉(zhuǎn)染lmb細胞。
2. 鼠實驗：研究將 LM2 - mCherry -熒光素酶細胞、BR16 - GFP -熒光素酶細胞及4T1 - GFP -熒光素酶細胞注射到8周的NSG雌性小鼠形成原位乳腺癌病灶。此外，研究也將4T1-CD90.1細胞注射于8周的BALB/c雌性小鼠，將E0771.lmb-CD90.1細胞原位注射于8周野生型大鼠或Bmal1基因敲除小鼠。接下來，分別在靜息期和活動期抽血進行CTC分析、器官解剖和IVIS生物發(fā)光成像。
3. 鼠的治療：研究在腫瘤發(fā)展后，用不同的晝夜調(diào)節(jié)激素治療小鼠。在腫瘤注射后10天開始使用褪黑素，此時腫瘤開始呈指數(shù)生長，并且外周血中尚未檢測到CTC。小鼠每日接受褪黑素或與luzindole 聯(lián)合治療，Luzindole在褪黑素處理前進行，褪黑素在靜息期(ZT :授時因子時間。ZT0:ZT0定義為早上6點開燈時)開始前給藥，接著在ZT0采血并進行CTC檢測。研究也在采血(ZT4:靜息期)前給予小鼠地塞米松，以避免下丘腦-垂體-腎上腺軸負調(diào)控環(huán)的激活。研究對腫瘤注射前4天的小鼠注射睪酮埋植劑，并保存至采血日(ZT4)。研究在腫瘤細胞注射后25天開始胰島素處置，以避免胰島素對腫瘤生長的影響。小鼠在每天ZT3(ZT3：靜息期)接受胰島素與葡萄糖并行處置，在ZT4和ZT16(活動期)進行采血和CTC檢測，所有給藥均采用腹腔注射的方式。
4. 時差綜合征實驗：研究在注射腫瘤1周后開始倒時差，將動物置于改變光周期的環(huán)境中，每2-3天提前8小時。在每個時差休息階段開始前1.5小時，每天給有時差反應的小鼠服用褪黑激素。靜息期開始采血并進行CTC分析。
5. CTC捕獲：研究對于患者樣本，采血后1小時內(nèi)進行CTC捕獲。小鼠則采用心臟穿刺取血并立即處理。對于免疫功能低下的模型，樣本僅染色CD45，在免疫正常模型中，抗CD45染色與CD90.1染色同時進行，分別識別白細胞和癌細胞。測定捕獲的CTC數(shù)量包括單個CTC、CTC簇和CTC - WBC簇。
6. 直接轉(zhuǎn)移測定:研究利用自動單細胞收集系統(tǒng)(ALS) CellCelector對單個CTC、CTC簇和CTC - WBC簇進行操作，然后將每個類別的CTC注入受體NSG小鼠的尾靜脈。利用IVIS生物發(fā)光系統(tǒng)每周無創(chuàng)監(jiān)測肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的發(fā)生和生長速度。
7. 免疫熒光染色和共聚焦分析及流式細胞術:研究對解剖的器官和原發(fā)腫瘤進行免疫熒光染色和共聚焦分析，小鼠腫瘤被切碎成碎片后進行流式細胞術。
8. ScRNA-seq:研究將收集的單個CTC、CTC簇和CTC -WBC簇轉(zhuǎn)入含有裂解液和抑制劑的單個試管中。并按照Smart-seq2方案制備擴增cDNA。使用Nextera XT (Illumina)制備文庫，在Illumina NextSeq500測序儀上以75-堿基對單讀模式進行測序，每個樣本的中位原始測序深度為164萬讀數(shù)。
9. RNA-seq分析：研究對測序讀數(shù)用Trim Galore進行了修整，采用FastQC對RNA-seq數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估，使用STAR和GENCODE注釋并將修剪后的讀數(shù)與人類基因組參考序列進行比對。研究也對小鼠RNA的殘留污染進行了消除。讀數(shù)計數(shù)使用R/Bioconductor中的edgeR包進行標準化，并利用R/Bioconductor中的scater包對數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制和可視化處理。標準化后，根據(jù)scran的getTopHVGs函數(shù)，使用生物成分最大的前500個基因的基因表達進行主成分分析。
10. 差異表達及GSEA: 研究利用 R/Bioconductor中的edgeR包計算差異表達，并利用Benjamini-Hochberg方法對P值進行了校正。使用R/Bioconductor中的clusterProfiler包進行GSEA。
四．主要內(nèi)容及結(jié)果
1. 晝夜節(jié)律和CTC內(nèi)滲
在文章第一部分，作者首先試圖確定在同一天的活動和休息的進展期乳腺患者的CTC豐度和組成。研究共納入30例患者(圖1a)，其中21例患者在采血時被診斷為早期乳腺癌，9例被診斷為ⅳ期轉(zhuǎn)移性乳腺癌。作者在休息階段的夜間采集樣本中發(fā)現(xiàn)了大量CTC，包括單個CTC、CTC簇和CTC -WBC簇(圖1a)。接下來為了檢驗這一發(fā)現(xiàn)的普遍性，并確定事件發(fā)生的精確時間，作者使用4種不同的乳腺癌小鼠模型移植乳腺癌細胞，并在腫瘤生長后，通過末端血液采樣和CTC捕獲來檢測隨時間推移自發(fā)產(chǎn)生的CTC。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與患者數(shù)據(jù)一致，大多數(shù)CTC事件出現(xiàn)在小鼠休息期樣本中(圖1b,c)。作者進一步當以每4小時為間隔對24小時進行時間動力學分析時，觀察到CTC釋放的振蕩模式非常明顯(圖1b)。當聚焦于小鼠晝夜節(jié)律的靜止期(ZT4)和活動期(ZT16)兩個最具代表性的時間點時，研究觀察到在所有測試的模型中，CTC的絕對計數(shù)和標準化計數(shù)均有顯著差異(圖1c)。鑒于這些結(jié)果，作者得出結(jié)論，靜息期和活動期觀察到的CTC豐度的主要差異歸因于內(nèi)滲率的差異。接下來作者嘗試用不同的方法打亂小鼠的生理節(jié)律，一方面改變正常的光暗(LD)周期，從而引發(fā)時差效應，另一方面，使用褪黑激素對對照組和有時差反應的小鼠進行治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照小鼠相比，時差誘導導致CTC減少。此外，作者也發(fā)現(xiàn)，褪黑素誘導會增加CTC、CTC簇和CTC -WBC簇的產(chǎn)生，褪黑素受體拮抗劑luzindole則會干預這些情況，也就是說褪黑素可增加CTC生成，而luzindole可在不影響原發(fā)腫瘤大小的情況下減少CTC生成。然后，作者也觀察到，在各種光照條件下，CTC數(shù)量在靜息期均持續(xù)增加，這表明光照在CTC內(nèi)滲中發(fā)揮關鍵作用。最后，考慮到CTC內(nèi)滲的振蕩模式及其與晝夜節(jié)律的關系，作者測試這些模式是否在基因敲除小鼠中被消除，研究使用野生型BL/6小鼠(BL/6-E0771.lmb)和Bmal1純合子敲除小鼠(BL/6- Bmal1?/?-E0771.lmb)(圖1d)，發(fā)現(xiàn)對照BL/6-E0771的CTC計數(shù)在心臟穿刺和腫瘤引流管（ tumour draining vessel，TDV）中都遵循一種典型的振蕩模式。在lmb小鼠中，CTC計數(shù)的振蕩在BL/6-Bmal1?/?E0771中消失。綜上所述，這些結(jié)果表明在乳腺癌患者和小鼠模型中，單個和集群CTC的釋放都是在睡眠期間實現(xiàn)的。
2. CTCs在睡眠時的轉(zhuǎn)移能力
在文章的第二部分作者研究了晝夜節(jié)律的不同階段產(chǎn)生的CTC是否具有不同的轉(zhuǎn)移潛能。作者使用GFP或RFP標記的NSG-LM2異種移植模型，在腫瘤發(fā)生后分離出ZT4 (GFP標記)和ZT16 (RFP標記)自發(fā)脫落的CTC，最終分離出150個ZT4產(chǎn)生的GFP標記的CTC和150個ZT16產(chǎn)生的RFP標記的CTC，每個CTC都由110個單個CTC、35個CTC簇和5個CTC -WBC簇組成，接著作者在晝夜節(jié)律的不同時間點進行無腫瘤受體小鼠的尾靜脈注射來測量這些CTC的直接轉(zhuǎn)移能力(圖2a)。結(jié)果通過體內(nèi)生物發(fā)光成像，作者發(fā)現(xiàn)在靜息期，尤其是ZT4的轉(zhuǎn)移負荷最高(圖2b)。接著為了分析這些轉(zhuǎn)移灶是否來源于ZT4或ZT16 CTC，作者使用抗GFP和抗RFP抗體進行了免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)轉(zhuǎn)移來自ZT4產(chǎn)生的GFP標記的CTC(圖2c)。這些結(jié)果表明ZT4 CTC對轉(zhuǎn)移灶的形成具有重要作用，并且在靜息期注射ZT4 CTC更容易形成轉(zhuǎn)移灶。接下來，作者試圖將這些發(fā)現(xiàn)擴展到更多的模型并精確量化靜息期與活動期單個CTC、CTC簇和CTC -WBC簇的轉(zhuǎn)移能力，因此作者使用NSG-CDX-BR16和NSG-LM2異種移植模型，在腫瘤發(fā)生后，捕獲分離自發(fā)脫落的CTC。然后，分離出單個CTC、CTC簇的CTC和CTC - WBC簇的CTC，這些CTC分別處于靜息期(ZT4)和活動期(ZT16)，接著作者在(ZT12:定義為下午6點熄燈)通過無腫瘤受體小鼠的尾靜脈注射這些CTC，來測定其直接轉(zhuǎn)移能力(圖2d)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與ZT16期間獲得的CTC相比，ZT4期間獲得的CTC表現(xiàn)出更強的轉(zhuǎn)移能力(圖2e)。此外，作者也發(fā)現(xiàn)，與活動期的CTC相比，靜息CTC簇和CTC - WBC簇似乎具有比單個CTC更強的轉(zhuǎn)移形成特征(圖2e)。總之，這些結(jié)果表明， 靜息期不僅CTC內(nèi)滲率增加，而且它們的轉(zhuǎn)移能力也會增強。
3. CTC基因表達的時間依賴性
接下來，在文章的第三部分作者試圖研究CTCs在靜止期和活動期轉(zhuǎn)移能力差異的分子特征。作者在小鼠晝夜節(jié)律的休息(ZT4)和活動(ZT16)階段分離出單個CTC, CTC簇和CTC - WBC簇，并分別對它們進行單細胞RNA測序(scRNA-seq;圖3 a)。在篩選了高質(zhì)量樣本后，作者從NSG-CDX-BR16模型中獲得了138個CTCs，從NSG-LM2模型中獲得了108個CTCs，代表了ZT4和ZT16的所有類型CTC。使用主成分分析，作者發(fā)現(xiàn)時間點(ZT4 . ZT16)是驅(qū)動CTC基因表達變化的關鍵特征(圖3b)。在靜息期(ZT4)和活動期(ZT16)分離的樣本中，差異基因表達顯示ZT4 CTC中有121個上調(diào)基因，ZT16 CTC中有156個上調(diào)基因，作者也觀察到，大多數(shù)定義ZT4和ZT16表達特征的基因在所有類型的CTC中都被一致地高度上調(diào)，但在CTC簇和CTC -WBC簇中統(tǒng)計學顯著性最高。這與單細胞樣本中預期的較高變異性和較高脫落率一致。對ZT4和ZT16期間上調(diào)基因的基因集富集分析(GSEA)也發(fā)現(xiàn)ZT4期間支持有絲分裂和細胞分裂的通路具有高度一致的活性，而ZT16期間則富集到支持核糖體生物發(fā)生和基因翻譯的通路。此外，在從乳腺癌患者在同一天活動期和休息期分離的人類CTC中，作者發(fā)現(xiàn)了與在小鼠模型中觀察到的相同的基因表達模式和通路活性(圖3f)，且在靜止期和活動期的不同時間點也一致(圖3g)?？紤]到CTC的半衰期短，作者推斷原發(fā)腫瘤也可以看到細胞增殖的振蕩變化。因此，作者使用NSG-CDX-BR16和NSG-LM2模型對增殖標志物Ki67及其CTC進行染色時，發(fā)現(xiàn)Ki67在靜息期顯著上調(diào)(圖3h)。總之，從患者和小鼠模型中分離出的CTC的分子基因表達分析展示了非常不同的基因表達模式。在睡眠期間，基因表達由細胞分裂和有絲分裂基因主導，而在活動期，則觀察到高核糖體生物發(fā)生活動。這種振蕩增殖時間不僅在CTC中觀察到，而且在原發(fā)腫瘤中也觀察到，這表明這是在疾病進展期間發(fā)生在乳腺癌細胞中的普遍現(xiàn)象。
4. CTC內(nèi)滲的調(diào)控因子
在文章的最后一部分，作者對晝夜節(jié)律驅(qū)動的CTC生成和增殖的主要調(diào)節(jié)因子的機制進行了研究。作者分析了來自異種移植物和患者CTC的RNA-seq數(shù)據(jù)，以確定晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)激素、生長因子或分子的受體表達水平，評估了受晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的候選受體表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素受體、雄激素受體和胰島素受體的表達在單個CTC、CTC簇和CTC - WBC簇中高度出現(xiàn)，這表明它們的配體參與了時間點驅(qū)動的CTC生成和增殖(圖4a)。為了檢驗這一假設，作者首先用地塞米松或睪酮治療荷瘤小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)靜息期地塞米松單次治療(ZT2)和睪酮顆粒植入均導致靜息期峰值時間采樣時單個CTC、CTC簇和CTC - WBC簇顯著減少(圖4b,c)，且地塞米松或睪酮治療不影響原發(fā)腫瘤的大小，但觀察到睪酮治療小鼠的轉(zhuǎn)移負荷降低。此外，考慮到胰島素刺激與隨后的細胞生長和分裂之間的聯(lián)系，作者研究了胰島素是否也會影響乳腺癌細胞的增殖時間和內(nèi)滲。作者每日在ZT3(靜息期)用胰島素和葡萄糖治療荷瘤小鼠1周，并分別定量靜息期和活動期的CTC豐度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靜息期胰島素治療降低了ZT4的CTC內(nèi)滲，增加了ZT16的CTC內(nèi)滲(圖4d)，而原發(fā)腫瘤體積沒有顯著變化。作者也發(fā)現(xiàn)在靜息期使用胰島素治療也會逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞的增殖周期(圖4 e)。總之，這些研究結(jié)果表明，乳腺癌細胞的增殖和內(nèi)滲是由關鍵的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)激素的每日波動決定的，這些激素的作用影響乳腺癌的轉(zhuǎn)移動力學。
到這里這篇文章的主要內(nèi)容就介紹完了。文章聚焦于睡眠與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關系，結(jié)合大量實驗與生信分析，證明靜息期CTC的內(nèi)滲及轉(zhuǎn)移能力會增強，并對這一現(xiàn)象的機制進行了分析。文章邏輯清晰，角度新穎，有理有據(jù)，為有轉(zhuǎn)移傾向癌癥的時間控制性研究和治療提供了新的理論基礎。
