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大家好呀！今天要給大家分享的是發(fā)表于PNAS（IF：11.205）上的一篇文章。話不多說，我們一起來看看吧~
致病性 TNF-α 在 Aire 缺陷型自身免疫模型中驅(qū)動周圍神經(jīng)炎癥
背景介紹
1. TNF α
腫瘤壞死因子-α. （TNF-α）是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，參與正常炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。其主要作用是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。
2. 疾病介紹
格林－巴利綜合征（Guillain-Barré syndrome，GBS）和慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病 （chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy，CIDP）都是周圍神經(jīng)系統(tǒng) (PNS) 的炎癥性疾病，臨床特征包括虛弱、感覺喪失、反射消失和疼痛等。GBS 和 CIDP 是由涉及細(xì)胞和體液因素的周圍神經(jīng)髓鞘的自身免疫性破壞引起的，但這種自身免疫性破壞對周圍神經(jīng)髓鞘的免疫耐受的確切機(jī)制尚不明確。目前常見的臨床治療僅限于非特異性作用機(jī)制的治療手段，如靜脈注射免疫球蛋白、糖皮質(zhì)激素和治療性血漿置換等。
3. NOD.AireGW/+小鼠介紹
在非肥胖性糖尿病（NOD）遺傳背景下，攜帶顯性功能喪失 Aire G228W 突變的小鼠（NOD.AireGW/+小鼠）會出現(xiàn)自發(fā)性自身免疫性周圍多發(fā)性神經(jīng)?。⊿APP），概括了 GBS 和 CIDP 的多個特征。由于 SAPP 和人類炎癥性神經(jīng)病之間的多個共同特征，該小鼠模型是了解炎性神經(jīng)病致病機(jī)制的常用模型之一。
數(shù)據(jù)組成
結(jié)果
1. 神經(jīng)性 NOD.AireGW/+小鼠坐骨神經(jīng)中的異質(zhì)免疫細(xì)胞中多種細(xì)胞因子通路上調(diào)
為了解坐骨神經(jīng)中的免疫細(xì)胞組成，研究人員對來自神經(jīng)性 NOD.AireGW/+小鼠坐骨神經(jīng)的免疫細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq分析（圖 1A），共鑒定出11 個免疫細(xì)胞群，包括有CD4+ T 細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、γδ T 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和自然殺傷T細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等（圖1B-D）。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，T 細(xì)胞（包括 Cd4、Cd8 和 Treg）是構(gòu)成坐骨神經(jīng)浸潤免疫細(xì)胞的主要細(xì)胞群，其次是 B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、cDC和pDC等細(xì)胞（圖1E）。圖 1 F-H結(jié)果顯示，IFN-γ 反應(yīng)和通過 NF-κB的TNF-α 信號傳導(dǎo)途徑在骨髓組（cDC 和巨噬細(xì)胞）細(xì)胞中表達(dá)顯著，且巨噬細(xì)胞高度表達(dá)通過 NF-κB的TNF-α信號傳導(dǎo)通路中的相關(guān)基因。綜上，研究人員推測骨髓細(xì)胞中顯著存在的TNF-α 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)可能在 SAPP 發(fā)展中起重要作用。
2. IFN-γ 由 T 細(xì)胞表達(dá)并誘導(dǎo)NOD.AireGW/+巨噬細(xì)胞中的 TNF-α 表達(dá)。
細(xì)胞通訊分析結(jié)果顯示，IFN-II（也稱為 IFN-γ）和TNF 信號通路網(wǎng)絡(luò)是免疫細(xì)胞群之間重要的信號通路，CD4+ 和 CD8+ T 細(xì)胞為IFN-γ 主要的來源細(xì)胞，骨髓細(xì)胞群為IFN-γ主要的靶細(xì)胞（圖 2A-C）。圖 2 D-F結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞是TNF-α 的主要來源，多種免疫細(xì)胞類型（包括巨噬細(xì)胞本身）是 TNF-α 靶細(xì)胞。同時，圖 2G流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，TNF-α 蛋白主要由 F4/80+ 巨噬細(xì)胞表達(dá)。與非巨噬細(xì)胞群相比，F(xiàn)4/80+ 巨噬細(xì)胞中 TNF-α 表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度顯著更高（圖 2H）。據(jù)報道，IFN-γ 可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中的 TNF-α 表達(dá)，故研究人員推斷由NOD.AireGW/+小鼠神經(jīng)中的 T 細(xì)胞產(chǎn)生的 IFN-γ 可能是刺激巨噬細(xì)胞 TNF-α表達(dá)的信號。為驗證其猜測，研究人員從NOD.AireGW/+ 小鼠中分離出骨髓來源的巨噬細(xì)胞 (BMDM)，并在存在或不存在 IFN-γ 的情況下分別對其進(jìn)行培養(yǎng)。實驗結(jié)果顯示，與未受刺激的 BMDM 相比，暴露于 IFN-γ 的 BMDM 中TNF-α 的表達(dá)顯著上調(diào)（圖2I）。
3. TNF-α介導(dǎo)的信號在自身免疫靶向的坐骨神經(jīng)中上調(diào)
圖 3A流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，與NOD.WT小鼠相比， NOD.AireGW/+ 小鼠的坐骨神經(jīng)中 CD45+ 免疫細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增加。研究人員通過對來自穩(wěn)態(tài)（B6.WT和NOD.WT）與自身免疫性（NOD.AireGW/+）小鼠的坐骨神經(jīng)免疫細(xì)胞 scRNA-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行組合分析，共鑒定出12 個主要免疫細(xì)胞群（圖 3B），其中Ctla4+ T 細(xì)胞僅來源于自身免疫性NOD.AireGW/+小鼠（圖 3C）。
研究人員接下來又對來自穩(wěn)態(tài)和自身免疫性小鼠坐骨神經(jīng)的免疫細(xì)胞之間的細(xì)胞信號模式進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，與 NOD.WT 相比，NOD.AireGW/+ 樣本中的信息流顯著增加，且僅在NOD.AireGW/+坐骨神經(jīng)中鑒定出IFNII（IFN-γ）和TNF信號通路（圖 2 D）。TNF-α 信號通路中的TNFR1 和 TNFR2受體分別由Tnfrsf1a 和 Tnfrsf1b 編碼，圖2E-F結(jié)果顯示，Tnfrsf1a 在巨噬細(xì)胞和 cDC 細(xì)胞中表達(dá)顯著增加，Tnfrsf1b 在 T 細(xì)胞、gd/NK/NKT、混合和巨噬細(xì)胞群中顯著增加。此外，與 NOD.WT 相比， NOD.AireGW/+的巨噬細(xì)胞群中的 Tnf 表達(dá)增加（圖 3F），并通過RT-qPCR和免疫組化染色得到驗證（圖 3G-H）。
4. 自身免疫與損傷巨噬細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征差異
為進(jìn)一步比較損傷和自身免疫性巨噬細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征變化，研究人員對來自損傷巨噬細(xì)胞和自身免疫性巨噬細(xì)胞的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析。通過聚類分析共劃分出7個不同的groups，其中g(shù)roup 1和group 2的巨噬細(xì)胞主要來源于 D1 損傷巨噬細(xì)胞，group 3和group 4的巨噬細(xì)胞主要來源于 D5 損傷巨噬細(xì)胞（圖 4 A 和 B）。值得注意的是，group 7巨噬細(xì)胞中 Tnf 表達(dá)最高（圖4C）。GSEA分析結(jié)果顯示，通過 NF-κB 的 TNF-α 信號傳導(dǎo)是group 7巨噬細(xì)胞中最為顯著的信號傳導(dǎo)途徑之一（圖4D）。此外，擬時間分析結(jié)果顯示，group 7巨噬細(xì)胞為 D5 損傷巨噬細(xì)胞軌跡的延伸（圖4E），故研究人員推測其中發(fā)生的表型變化是從神經(jīng)損傷修復(fù)結(jié)束時的修復(fù)狀態(tài)變?yōu)榫哂凶陨砻庖叩拇傺谞顟B(tài)。
5. 自身免疫性周圍神經(jīng)病通過抗 TNF-α 抗體治療和基因 TNFR 消融得到改善
研究人員為確定 TNF-α 是否是周圍神經(jīng)自身免疫性脫髓鞘所必需的，通過在小鼠模型中進(jìn)行抗體介導(dǎo)的 TNF-α 阻斷效果測試。結(jié)果顯示，雖然所有未經(jīng)治療的 7 只小鼠都出現(xiàn)神經(jīng)病變，但抗 TNF-α 抗體治療的 14 只小鼠中有 13 只成功預(yù)防神經(jīng)病變（圖 5A）。H&E 染色和流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，抗 TNF-α 治療的NOD.AireGW/+小鼠的免疫浸潤顯著降低（圖 5 B 和 C）。
接下來，研究人員還遺傳方法驗證TNF-α 阻斷對 PNS 自身免疫發(fā)展的影響，構(gòu)建了TNFR1 和TNFR2雙缺陷型NOD.AireGW/+小鼠（NOD.AireGW/ +Tnfrsf1a-/- Tnfrsf1b-/-）。實驗結(jié)果顯示，雖然所有NOD.AireGW/+小鼠（n = 16）在 30 周齡時出現(xiàn)神經(jīng)病變，但NOD.AireGW/ +Tnfrsf1a-/- Tnfrsf1b-/-小鼠（n = 19）可以成功預(yù)防病變出現(xiàn)（圖 5E）。綜上結(jié)果顯示，通過用抗 TNF-α 抗體治療或通過 TNFR1 和 TNFR2的遺傳缺陷阻斷 TNF-α 活性，可防止自身免疫性周圍神經(jīng)病變的發(fā)展。
6. TNFR1 促進(jìn) PNS 自身免疫并誘導(dǎo)NOD.AireGW/+巨噬細(xì)胞中多種自身免疫相關(guān)基因的表達(dá)
研究人員進(jìn)一步探究了TNFR1 缺失對神經(jīng)病變發(fā)展的影響，圖6A結(jié)果顯示，僅有TNFR1 缺失也可保護(hù)NOD.AireGW/+小鼠免受SAPP病變。H&E 染色和流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，來自 TNFR1 缺失型 (Tnfrsf1a-/-) NOD.AireGW/+小鼠坐骨神經(jīng)的免疫浸潤程度顯著降低（圖 6 B 和 C）。此外，對坐骨神經(jīng)的神經(jīng)傳導(dǎo)研究表明，TNFR1缺失可防止脫髓鞘（圖 6D）。
小結(jié)
本文通過單細(xì)胞 RNA 測序分析自身免疫攻擊期間神經(jīng)中的免疫細(xì)胞，揭示了一個巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的TNF-α信號網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)在受自身免疫影響的坐骨神經(jīng)免疫細(xì)胞中顯著上調(diào)。自身免疫相關(guān) T 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，促進(jìn)巨噬細(xì)胞中 TNF-α 的表達(dá)上調(diào)。相比之下，損傷后周圍神經(jīng)巨噬細(xì)胞中 TNF-α 的表達(dá)和信號傳導(dǎo)會顯著降低，這表明最大限度地減少 TNF-α 活性可能是實施修復(fù)性巨噬細(xì)胞狀態(tài)的關(guān)鍵。事實上，TNF-α 信號的基因消融以及基于抗體的 TNF-α 阻斷，可以防止自身免疫性神經(jīng)病變的發(fā)展。綜上所述，增加的 TNF-α 信號傳導(dǎo)是 PNS 自身免疫的一個決定性特征，可能將是一個有效的臨床治療手段。
參考文獻(xiàn)
Wang Y, Guo L, Yin X, McCarthy EC, Cheng MI, Hoang AT, Chen HC, Patel AY, Allard Trout D, Xu E, Yakobian N, Hugo W, Howard JF Jr, Sheu KM, Hoffmann A, Lechner MG, Su MA. Pathogenic TNF-α drives peripheral nerve inflammation in an Aire-deficient model of autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Jan 25;119(4):e2114406119.
