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今天給大家分享一篇2022年6月17日發(fā)表在iScience（IF:6.107）上，模擬太空旅行中的長期隔離相關的DNA甲基化動態(tài)改變的文章。
DNA methylation dynamics associated with long-term isolation of simulated space travel
模擬太空旅行中的長期隔離相關的DNA甲基化動態(tài)改變
一．研究背景
長期太空飛行中的人類將遇到五種危險，包括輻射、隔離和限制、與地球的距離、重力以及敵對和封閉的環(huán)境，據報道，長期隔離會在多個方面影響宇航員的健康，包括晝夜節(jié)律紊亂，神經肌肉功能受損、認知障礙、海馬功能受損、焦慮增加和免疫失調。為了更好地應對未來航天任務中的這些潛在健康風險，有許多研究分析了長期隔離期間分子和細胞水平的變化。DNA甲基化是調節(jié)基因表達的一種重要的表觀遺傳修飾，據報道也會受到長期隔離或太空飛行的影響。在NASA’s Twins Study中，研究人員發(fā)現了航天飛行中全基因組平均甲基化水平（MML）的變化，并發(fā)現啟動子局部甲基化變化的基因與地面對照相比，富集在完全不同的功能中。
已證實異常DNA甲基化與許多人類疾病有關。因此，分析長期分離過程中DNA甲基化的變化對保護航天員的健康具有重要意義。與NASA’s Twins Study的結論類似，有一些研究揭示了模擬太空旅行中的長期隔離相關的DNA甲基化改變。然而，以往的研究僅關注分離組和對照組之間DNA甲基化水平的差異，長期分離過程中DNA甲基化變化的動態(tài)過程尚未得到充分研究。
二．研究方法
本研究試圖研究與長期分離相關的DNA甲基化動力學，并探討其功能意義?；凇癕ars-500”任務六個時間點的六名機組人員血液中450k甲基化數據，通過多步驟時間序列分析策略確定了六種DNA甲基化的動態(tài)模式，包括“Dec-Inc”（DNA甲基化水平在長期隔離期間先降低后升高）、“Inc-Dec”（ 甲基化水平在長期分離期間先升高后降低）、“Inc-Dec-Inc”（DNA甲基化水平在長期分離期間先升高，然后降低，然后升高）、“Ear-Dec”（DNA甲基化水平在長期分離的早期降低），“Mid-Dec”（DNA甲基化水平在長期分離的中期降低）和“Dec-Inc-Dec”（DNA甲基化水平在長期分離期間先降低，然后升高，然后降低）。在這六種模式中，73%的CpG位點在隔離后可以恢復到基線，其余位點與基線相比減少。對六種模式的通路富集分析發(fā)現了較強的功能特異性，如Dec-Inc基因在腦發(fā)育中顯著富集，Dec-Inc-Dec基因在激活誘導的T細胞死亡中顯著富集。此外，還發(fā)現幾種模式與一些常見疾病有關，如神經系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病和癌癥。綜上所述，該研究描述了長期分離過程中DNA甲基化的動態(tài)模式，并揭示了其重要的功能意義，這將為未來長期太空飛行中保護宇航員健康提供新的方面。
三．研究結果
1、太空旅行長期隔離期間的全局甲基化特征
從“Mars-500”任務中獲得了跨越六個時間點的六名乘員的36個DNA甲基化圖譜，這些樣本的DNA甲基化水平由Illumina Infinium Humanmethylization450k BeadChip檢測。排除低質量探針后，保留373309個探針用于以下分析。每個樣本的整體DNA甲基化水平服從典型的雙峰分布（圖1A）。進行t-SNE分析發(fā)現來自同一人不同時間點的樣本聚集在一起，這表明與長期隔離期間的乘員相比，時間點之間的變化較?。▓D1B）。在這里，更加關注長期隔離對DNA甲基化的影響，因此糾正了乘員之間的遺傳背景差異。正如預期的那樣，調整了乘員之間的差異，并按時間點將樣本聚集在一起（圖1C）。連續(xù)兩個時間點顯示出更大的甲基化相似性，例如-7天和60天，168天和300天，以及512天和527天（圖1C），這表明在長期分離期間，全局DNA甲基化經歷了動態(tài)變化。
接下來，通過平均來自同一時間點的樣本來研究六個時間點之間的整體甲基化變化。觀察到中位甲基化水平從-7天和60天輕微增加到168天和300天，然后在接近任務結束時（512天和527天）恢復到基線（隔離前：-7天）（圖1D）。此外，還發(fā)現，大多數CpG位點在長期隔離期間發(fā)生了微小變化，并且只有~1%（n=4892）位點變化大于0.1（圖1E）。綜上所述，在長期隔離期間，整體DNA甲基化變化很小，但可以觀察到不同時間點之間的動態(tài)變化。
2. 長期分離過程中的六種DNA甲基化動態(tài)模式
接下來，采用多步驟分析策略來確定長期分離過程中的DNA甲基化動態(tài)模式。多步驟策略包括過濾六個乘員之間不一致的波動CpG，過濾六個時間點之間變化較小的CpG，識別差異甲基化CpG和聚類顯著波動的CpG。通過上述分析，總共確定了22個具有高度相似甲基化趨勢的簇，包括3755個位點。簇之間的相似性通過自組織映射（SOM）網絡圖來說明，其中簇越相似，它們在SOM網絡圖中就越接近（圖2A）。因此，根據簇的相似性對其進行了進一步分組。因此，將所有22個堿基分為六種DNA甲基化模式，分別命名為“Dec-Inc”、“Inc-Dec”、“Inc-Dec-Inc”、“Ear-Dec”、“Mid-Dec”和“Dec-Inc-Dec”（圖2B）。具體來說，Dec-Inc包括11個簇（簇1、2、3、8、9、11、12、16、17、18和19）（圖2C），它們在SOM網格圖中彼此接近（圖2A）。類似地，Inc-Dec包括四個簇（簇6、7、13和14）（圖2C）。Inc-Dec-Inc包括一個簇（簇22）（圖2C）。Ear-Dec包括兩個簇（簇15、20）（圖2C）。Mid-Dec包括一個簇（簇21）（圖2C）。最后，Dec-Inc-Dec包括三個簇（簇4、5和10）（圖2C）。此外，這六種模式也被分為兩類，稱為“恢復”，即分離后的甲基化水平可以恢復到基線，并“下降”，這意味著在分離期間甲基化水平持續(xù)下降（圖2B）。直觀地說，發(fā)現最顯著波動的甲基化位點（73%，n=2732）被歸類為“正在恢復”（圖2B），這與NASA’s Twins Study的結論一致，即飛行中的全基因組平均甲基化水平（MML）與飛行前略有不同，并在飛行后恢復到基線水平。值得注意的是，仍有1023個位點被歸類為“減少”（圖2B）。此外，在長期隔離期間未發(fā)現任何增加模式（圖2B）。此外，注意到有兩個具有雙轉折點的復雜模式：Inc-Dec-Inc和Dec-Inc-Dec，其中Inc-Dec-Inc分為“恢復”，Dec-Inc-Dec分為“減少”（圖2B）。雖然分為不同的類別，但它們都在隔離開始時發(fā)生變化，然后在隔離期間恢復，最后在隔離后再次發(fā)生變化（圖2B），這表明這兩種模式可能容易受到環(huán)境變化的影響。綜上所述，該研究在長期分離過程中發(fā)現了六種DNA甲基化動態(tài)模式，反映了長期分離對DNA甲基化的復雜影響，為從不同的甲基化動態(tài)模式角度深入研究長期分離造成的危害提供了有力支持。
3. DNA甲基化模式的功能分析
根據這六種DNA甲基化模式，進一步研究了它們的生物學功能。先前的研究表明，位于啟動子和CpG島的異常DNA甲基化在基因表達調控中發(fā)揮了重要作用。注意到六種模式中有44%的CpG位點位于基因啟動子區(qū)，而只有17%的位點位于CpG島區(qū)（圖3A）。此外，除在TSS1500區(qū)域富集的Ear-Dec外，幾乎所有模式在啟動子或CpG島區(qū)域均未顯著富集（圖3B）。這些觀察結果表明，大多數甲基化動態(tài)模式并沒有特異性地出現在功能區(qū)（啟動子和CpG島）。
雖然動態(tài)模式在功能區(qū)總體上并不豐富，但假設某些基因啟動子的局部甲基化變化可以影響其表達。因此，根據位點是否位于基因的啟動子區(qū)域來確定每個模式的模式基因。值得注意的是，只有針對每種模式的蛋白質編碼基因被納入后續(xù)分析。使用Metascape對模式基因進行路徑富集分析。值得注意的是，以不同模式富集的途徑具有明顯的特異性（圖3C），這表明，不同的模式可能起著不同的作用在維持長期隔離期間的正常生物學功能。
由于功能冗余，使用Metascape對富集的通路信息進行聚類，并構建了一個功能網絡（圖3D）。與上述結論一致，在功能網絡中也觀察到了模式的特異性（圖3D）。特別是，Dec-Inc基因在一些基本生物過程中特別富集，如細胞形態(tài)發(fā)生、發(fā)育生長等（圖3D）。Inc-Dec-Inc和Dec-Inc-Dec基因分別在T細胞激活和激活誘導的T細胞死亡中特異性富集（圖3D）。特別是，一些重要的富集通路已被證明與長期太空飛行或隔離有關，包括大腦發(fā)育、行為功能障礙、免疫失調。總之，通路富集分析表明，大多數甲基化模式功能在模式內是一致的，但在模式間是特定的，其中一些功能已被報道與長期太空飛行和隔離有關，這為模式的客觀存在提供了有力支持，并為制定應對航天中長期隔離的對策提供了潛在價值。
4. 甲基化模式與人類疾病的關系
為了進一步驗證甲基化模式的功能，探索了甲基化模式與人類疾病之間的關系。從DisGeNET數據庫下載了人類疾病基因，并應用超幾何測試確定模式基因是否在疾病基因中特異富集。因此，Dec-Inc基因在最多數量的疾?。?9種疾?。┲懈患?，其他模式基因（Inc-Dec、Ear-Dec和Dec-Inc-Dec）在總共19種疾病中富集。據報告，一些疾病與長期太空飛行或隔離有關，例如心血管疾病、腫瘤、精神障礙、營養(yǎng)和代謝疾病。
特別是，該研究還發(fā)現Dec-Inc基因主要在神經系統(tǒng)疾病中富集（24/49）（圖4A）?？紤]到Dec-Inc的特征，即甲基化水平下降，然后在任務期間恢復到基線，可以推測身體的神經系統(tǒng)沒有受到不可逆轉的損害，盡管確實受到長期隔離的影響。此外，Inc-Dec基因主要在消化系統(tǒng)疾病中富集（4/7）（圖4A）。與Dec-Inc類似，Inc-Dec也在執(zhí)行任務后恢復，這意味著長期隔離可能會影響身體的消化功能，但不會對身體造成不可逆轉的傷害。此外，還發(fā)現包括Ear-Dec和Dec-Inc-Dec在內的兩種“減少”模式與一些人類疾病相關，其中Ear-Dec基因僅在腫瘤（頭頸部鱗狀細胞癌）中富集，Dec-Inc-Dec基因在包括消化系統(tǒng)疾病在內的多種疾病中表現出不同的富集（3/8），腫瘤（3/8）和精神障礙（2/8）（圖4A）。正如所知，啟動子甲基化通常與基因表達抑制有關。因此，這兩種“下降”模式可能意味著疾病相關基因的上調，這可能是發(fā)展疾病的潛在風險。因此，兩種“下降”模式與相關疾病之間的關系值得研究人員在未來進一步研究，以確保宇航員在長期太空飛行期間的身心健康。
值得注意的是，腫瘤是唯一與兩種“下降模式”相關的疾病類型，其中Ear-Dec基因在“頭頸鱗狀細胞癌”中富集，Dec-Inc-Dec基因在三種“急性髓系白血?。ˋML）”相關疾病中富集（圖4A）。因此，進一步探討了這兩種模式在腫瘤發(fā)生中的作用，以找出長期隔離與癌癥之間的關系。從ONGene和TSGene2.0數據庫下載了癌基因和抑癌基因。發(fā)現Dec-Inc-Dec基因和兩種模式的結合顯著富集腫瘤抑制基因，這表明長期分離可能增加腫瘤抑制基因的表達，因此可能對腫瘤有抑制作用。與推斷一致，Nwanaji-Enwerem等人發(fā)現“Mars-500”任務期間“epiTOC2”減少?！癳piTOC2”表示有絲分裂年齡的估計，“epiTOC2”的減少表示癌癥風險降低。
為了驗證這一推斷，進一步比較了這兩種模式在腫瘤和健康對照組之間的表達。此處僅考慮“AML”，因為四種富集腫瘤中有三種與AML相關（圖4A）。因此，從公共數據集（ArrayExpress:E-MTAB-220，GEO:GSE30029）下載了AML樣本及其健康對照的兩個基因表達譜。將Ear-Dec基因、Dec-Inc-Dec基因及其結合視為三個功能基因集，并使用單樣本基因集富集分析（ssGSEA）評估這三個基因集在急性髓系白血病樣本和對照中的活性。因此，除E-MTAB-220中的Ear-Dec外，這兩個數據集均顯示健康樣本中三個基因集的活性顯著高于急性髓系白血病樣本中的活性（圖4B）。結合上述發(fā)現，可以得出結論，長期分離可能上調腫瘤樣本中活性相對較低的基因的整體表達，使其活性更接近健康狀態(tài)，從而抑制癌癥。
四、總結
總之，利用模擬太空飛行“Mars-500”的DNA甲基化數據，對DNA甲基化變化進行了表征，并確定了長期分離期間的六種甲基化動態(tài)模式。通過功能分析和與疾病的關聯分析，發(fā)現不同的甲基化模式在影響生物過程或人類健康方面發(fā)揮著不同的作用。特別是，Inc-Dec-Inc和Dec-Inc-Dec兩種模式與長期隔離后的免疫反應顯著相關，另外兩種模式Ear-Dec和Dec-Inc-Dec被發(fā)現與癌癥風險降低有關，值得進一步研究，以獲得更多的組學數據和更多的樣本，為未來長期太空飛行中宇航員的健康提供保護。
