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給大家分享一篇?jiǎng)倓偘l(fā)表在Cell Discovery（IF：38.079）上的文章。作者根據(jù)人類(lèi)和小鼠HCC腫瘤的單細(xì)胞RNA測(cè)序顯示CAF的異質(zhì)性。這項(xiàng)工作闡明了特定CAF亞群功能在理解腫瘤微環(huán)境和免疫系統(tǒng)之間相互作用的重要性。
肝細(xì)胞癌(HCC)是一種具有高度細(xì)胞異質(zhì)性的免疫治療耐藥惡性腫瘤。細(xì)胞類(lèi)型的多樣性以及腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞之間的相互作用仍有待闡明。80%以上的HCC病例以成纖維細(xì)胞的激活、增殖和積累引起的廣泛肝纖維化為特征。HCC的腫瘤微環(huán)境（TME）的一個(gè)顯著特征是大量的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs），它可以分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子，直接或間接地支持癌細(xì)胞。這些CAF衍生因子對(duì)癌細(xì)胞來(lái)說(shuō)不僅是直接的生存信號(hào)，也通過(guò)抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的活性和招募免疫抑制細(xì)胞來(lái)改變免疫細(xì)胞環(huán)境，使癌細(xì)胞能夠逃避免疫監(jiān)視。在HCC中，基質(zhì)異質(zhì)性，特別是CAFs，以及惡性細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在單細(xì)胞分辨率下的相互作用仍然知之甚少。盡管先前的研究報(bào)道了CAFs通過(guò)各種機(jī)制調(diào)節(jié)肝癌的進(jìn)展，而不管腫瘤中的CAF亞型如何，目前尚不清楚HCC中是否存在不同的CAF亞群的原機(jī)制，而且CAFs與TME中其他成分之間的復(fù)雜串?dāng)_仍不清楚，特別是對(duì)于不同CAF亞型。
來(lái)自未治療的HBV相關(guān)HCC（與乙型肝炎病毒有關(guān)的肝癌）患者的7個(gè)腫瘤和其中4個(gè)患者的相鄰肝組織的90572個(gè)細(xì)胞(圖1a，b)。使用已知的標(biāo)記基因可以將細(xì)胞劃分為9種不同的細(xì)胞類(lèi)型。值得注意的是，上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞以及包括MDSCs、T細(xì)胞、DC和CAFs在內(nèi)的其他細(xì)胞具有高度的患者特異性，這表明HCC樣本之間存在顯著的分子瘤間異質(zhì)性。
80%以上的HCC病例以成纖維細(xì)胞活化和聚集引起的廣泛肝纖維化為特征(圖1d)。每個(gè)亞簇顯示出不同的轉(zhuǎn)錄組特征(圖1e-g)。
接下來(lái)，作者進(jìn)行了更深入的CAF表征，將研究擴(kuò)展到小鼠HCC模型(圖2a，b)。HCC腫瘤中成纖維細(xì)胞的比例與人類(lèi)HCC樣本中相似。除膽管細(xì)胞外，所有小鼠HCC腫瘤中存在所有類(lèi)型的細(xì)胞。
從7個(gè)小鼠肝癌腫瘤的CAFs聚類(lèi)為7個(gè)亞群，每個(gè)子簇顯示出不同的轉(zhuǎn)錄組特征(圖2c-e)。人類(lèi)HCC腫瘤中發(fā)現(xiàn)的所有5種CAF亞型在小鼠HCC組織中也有表達(dá)(圖2c)。CD36+CAFs和lpCAFs富集了上調(diào)通路，包括ROS通路和膽固醇代謝(圖2f)。
mIF檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD36+ CAFs在人類(lèi)和小鼠HCC腫瘤的腫瘤核心區(qū)域比腫瘤周?chē)鷧^(qū)域更富集。此外，BCLC-B中l(wèi)pmCAFs和lpCAFs的豐度比在BCLC-A期HCC中更豐富。使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分離人類(lèi)相鄰肝組織中的成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞可以聚集成相同的5種CAF亞型。CD36+ CAFs在HCC腫瘤中特異性富集(圖3a，b)，而vCAFs在腫瘤中的數(shù)量略高于鄰近肝組織(圖3b，c)，這些結(jié)果在獨(dú)立數(shù)據(jù)集中得到了驗(yàn)證（圖3d，e)。
偽時(shí)序分析表明狀態(tài)轉(zhuǎn)換軌跡包含兩個(gè)譜系，呈現(xiàn)出從祖細(xì)胞狀態(tài)到終端效應(yīng)狀態(tài)的分叉結(jié)構(gòu)(圖3f，g)。兩個(gè)譜系都從“祖細(xì)胞”狀態(tài)開(kāi)始，在中間狀態(tài)之后發(fā)散。觀(guān)察到以CAF轉(zhuǎn)分化為特征的mCAFs位于祖細(xì)胞狀態(tài)，lpmCAFs(CD36+ CAFs)處于中間狀態(tài)，最終分化為vCAFs、lpCAFs和apCAFs，向最終效應(yīng)狀態(tài)動(dòng)態(tài)過(guò)渡。
之后，作者進(jìn)行了細(xì)胞間相互作用分析。在9種細(xì)胞組中檢測(cè)到71對(duì)顯著配體受體對(duì)，并將其進(jìn)一步分為25條信號(hào)通路(圖4a）。MIFCD74/CXCR4在CAFs與B細(xì)胞、DC、MDSCs、單核或巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和T細(xì)胞的相互作用中位居首位。腫瘤細(xì)胞和CAFs是MIF配體作用于MDSCs、單核或巨噬細(xì)胞和DC的主要來(lái)源(圖4d)。lpmCAFs和lpCAFs是最主要的MIF配體來(lái)源(圖4e-h)。MIF的表達(dá)主要來(lái)源于CD36+ CAFs和lpCAFs，它們是MIF配體作用于MDSCs和DCs的主要來(lái)源(圖4i)。
作者使用SCENIC識(shí)別了CAF亞型中高度活躍的TF及其target(圖5a，b)。
這些結(jié)果確定了在已確定的CAF亞型中驅(qū)動(dòng)或維持基因表達(dá)程序的關(guān)鍵TF，為肝癌腫瘤CAF異質(zhì)性背后的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了進(jìn)一步的見(jiàn)解。
在所有已知的配體-受體對(duì)中，MIF信號(hào)通路主要由MIF配體及其CD74/CXCR4受體主導(dǎo)，通常高表達(dá)CD36的lpmCAFs和lpCAFs是作用于MDSCs的MIF配體的最主要來(lái)源(圖4g)。免疫組化實(shí)驗(yàn)表明，CD36的表達(dá)主要位于HCC間質(zhì)區(qū)。因此，使用特異性表面標(biāo)記物在lpmCAFs 和lpCAFs這兩個(gè)亞簇中鑒定了CD36，發(fā)現(xiàn)它們都富集在脂肪形成途徑中(圖5g)，表明它們?cè)贖CC進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。MIF實(shí)驗(yàn)表明，CD36+ CAFs特異性浸潤(rùn)于腫瘤組織(圖5h，i)。
scRNA-seq數(shù)據(jù)和TCGA數(shù)據(jù)顯示CD36+ CAFs與MDSCs呈正相關(guān)，與效應(yīng)T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(圖5j-l)。此外，對(duì)12例HCC腫瘤進(jìn)行snRNA-seq，發(fā)現(xiàn)CD36+ CAFs的數(shù)量與MDSCs呈正相關(guān)(圖5m)。這些結(jié)果表明CD36+CAFs可能在HCC中具有有效的免疫抑制作用。
為了分離和表征CAF亞群，作者首先確定了在每個(gè)CAF亞群中唯一表達(dá)的表面蛋白。在排除免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞后，鎖定了ACTA2陽(yáng)性細(xì)胞(圖6a)。使用CD36、CD146、FAP和MHCII抗體，CAFs被分離成4個(gè)群體：(1)CD36陽(yáng)性、(2)MHCII陽(yáng)性、(3)FAP陽(yáng)性和(4)CD146陽(yáng)性細(xì)胞，分別對(duì)應(yīng)CD36+ CAFs、apCAFs、mCAFs和vCAFs(圖6a)。
CD31和EpCAM雙陰性人群中，小鼠和人HCC腫瘤中CAF亞型的比例大致相似(圖6b)。CD36陽(yáng)性CAFs在Cd36、Fabp4和Sh3bp5以及l(fā)pCAF標(biāo)記Fabp5、Apoc1和Fasn的高表達(dá)方面是獨(dú)特的(圖6c)。CD36+ CAFs在肝星狀細(xì)胞(HSCs)中也發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)基因，如Lrat和Gfap31，作者猜測(cè)CD36+ CAFs可能起源于HSC。在小鼠肝癌腫瘤中，大約96%的CD36+ACTA2+成纖維細(xì)胞是Lrat系陽(yáng)性細(xì)胞。這些結(jié)果表明，Lrat系間質(zhì)細(xì)胞是小鼠肝癌發(fā)展過(guò)程中CD36+ CAFs的主要來(lái)源。
qPCR和ELISA實(shí)驗(yàn)表明，CD36+ CAFs衍生的MIF表達(dá)明顯高于vCAFs、mCAFs、apCAFs和HSC(圖6d，e)。在CD36+ CAFs中沉默CD36時(shí)，MIF的表達(dá)和分泌減少，表明MIF的表達(dá)可能受到CD36的調(diào)控(圖6f)。這些結(jié)果表明CD36+ CAFs可能通過(guò)旁分泌信號(hào)促進(jìn)MDSCs中某些腫瘤促進(jìn)功能的獲得。（CD36是一種清道夫受體，在脂質(zhì)代謝中起作用，據(jù)報(bào)道參與炎癥反應(yīng)和代謝障礙，如糖尿病和肥胖。在免疫系統(tǒng)中，CD36已被報(bào)道介導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞抗原的獲取和呈遞，并支持調(diào)節(jié)性Tf細(xì)胞功能。）
OxLDL是組織中磷膽堿(OxPL)的另一個(gè)豐富來(lái)源。CD36+ CAFs比CD36kd CAFs具有更高的OxLDL攝取率，CD36+ CAFs脂質(zhì)過(guò)氧化顯著增加，并且OxLDL以劑量依賴(lài)的方式增強(qiáng)CD36+ CAFs中的脂質(zhì)過(guò)氧化(圖6i-l)。
氧化應(yīng)激可激活p38激酶及其下游信號(hào)通路。OxLDL在CD36+ CAFs中誘導(dǎo)p38磷酸化(圖6n，m)。這表明OxLDL通過(guò)CD36和脂質(zhì)過(guò)氧化促進(jìn)p38激活。接下來(lái)，在p38抑制劑SB203580存在或不存在的情況下，用OxLDL處理CD36+ CAFs。結(jié)果顯示，OxLDL存在時(shí)，p38抑制部分抑制了MIF的分泌(圖6o)，表明OxLDL部分通過(guò)p38激活促進(jìn)了MIF的分泌。
對(duì)脂質(zhì)代謝至關(guān)重要的CEBP家族(CEBPA和CEBPD)TF在CD36+ CAFs(包括lpmCAFs和lpCAFs)中特異性富集。當(dāng)CEBPA和CEBPD分別沉默時(shí)， OxLDL處理的CD36+ CAFs中MIF顯著降低(圖6p)。染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)結(jié)果顯示CEBPA和CEBPD都可以直接與MIF啟動(dòng)子結(jié)合(圖6p)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明CD36通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化/p38/CEBP軸介導(dǎo)OxLDL攝取促進(jìn)MIF表達(dá)。
作者實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD36+ CAF-CM，MIF增加CD33+ MDSCs的數(shù)量，CD36+ CAF-CM+ ISO-1和CD36+CAF-CM+ CD74阻斷蛋白在抑制CD33+ MDSC擴(kuò)張方面表現(xiàn)出良好的活性(圖7c)，這表明MIF分泌是CD36+ CAFs調(diào)節(jié)MDSC擴(kuò)張的重要中介。
共注射從小鼠肝癌腫瘤中分離出的CD36+ CAFs可顯著促進(jìn)小鼠肝臟中肝癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移，特異性下調(diào)CD36、抑制MIF或消耗Gr-1+ MDSCs可大大減弱這種作用(圖7d，e)。共注射CD36+ CAFs可顯著增加Treg的浸潤(rùn)，減少腫瘤中效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)，特異性下調(diào)CD36、抑制MIF或耗損Gr-1+ MDSCs也可顯著減弱這種作用(圖7f，g)。這些數(shù)據(jù)表明CD36+ CAFs的促瘤作用是由MDSCs的免疫抑制功能間接介導(dǎo)的。
MDSCs可以通過(guò)幾種接觸非依賴(lài)性機(jī)制促進(jìn)免疫抑制，包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，已知iNOS可抑制實(shí)體腫瘤中CD8+ T和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和功能。首先，作者發(fā)現(xiàn)來(lái)自CD74或MDSC阻斷的細(xì)胞的CD36+ CAF-MDSC-CM顯著促進(jìn)了MDSCs中iNOS的分泌(圖7h)。此外，共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，CD36+ CAF+ MDSC組CD69+、IFNG+ CD8+ T細(xì)胞比例明顯下調(diào)，但Tregs和PD1+CD8+ T細(xì)胞比例上調(diào)，而CD36+ CAFs+ MDSC+ ISO-1或CD74阻斷的影響較小(圖7i、j)。這表明CD36+ CAFs通過(guò)MIF/CD74/ iNOS軸以成纖維細(xì)胞CD36依賴(lài)的方式增強(qiáng)CD33+ MDSCs的免疫抑制能力。
腫瘤細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，CD36+ CAF-MDSC-CM極大地促進(jìn)了HCC細(xì)胞系中腫瘤球的形成效率，而CD36+ CAFs或CD33+ MDSCs對(duì)CM的刺激只引起輕微的影響。這些結(jié)果表明CD36+ CAFs通過(guò)旁分泌MIFCD74軸以成纖維細(xì)胞CD36依賴(lài)的方式增強(qiáng)CD33+ MDSCs的干性增強(qiáng)能力。
最后，為了探索CD36+ CAF衍生的MIF影響MDSCs的分子機(jī)制。NF-κB信號(hào)通路在CD36+ CAF衍生MIF預(yù)處理的MDSCs中被激活(圖7k，l)。CD36+ CAFs誘導(dǎo)MDSCs中p65的磷酸化增加(圖7m)。據(jù)報(bào)道，p65激活可顯著誘導(dǎo)iNOS和IL-6分泌。CD36+ CAFs或MIF誘導(dǎo)的MDSCs iNOS和IL-6分泌顯著上調(diào)(圖5n)。
為了進(jìn)一步研究CD36+和MIF+ CAFs是否在HCC的發(fā)生中起作用。在小鼠體內(nèi)敲除CD36或MIF后，HCC腫瘤負(fù)荷和MDSCs比例顯著降低(圖8a-d)，表明CD36+ CAFs參與了HCC的發(fā)生。據(jù)報(bào)道，單核細(xì)胞MDSCs具有免疫抑制作用，并與癌癥免疫治療反應(yīng)差相關(guān)。靶向治療或減少M(fèi)DSCs聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)阻斷劑可以增強(qiáng)T細(xì)胞免疫治療。假設(shè)CD36+ CAFs的數(shù)量與HCC患者免疫治療的療效有關(guān)。
首先研究了接受抗PD-1治療的患者。結(jié)果顯示，抗PD-1應(yīng)答組CD36和αSMA共表達(dá)低于無(wú)應(yīng)答組，表明CD36+ CAFs數(shù)量較低預(yù)示著更好的HCC免疫治療應(yīng)答(圖8e，f)。然后，作者又討論了單藥和聯(lián)合治療策略。聯(lián)合治療在這些HCC小鼠模型中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤療效(圖8g-k)，Treg和MDSCs的比例下降，IFN-γ+和顆粒酶B+ CD8+ T細(xì)胞的比例增加(圖8l-m)。
作者使用scRNA-seq全面描繪了人類(lèi)HCC的轉(zhuǎn)錄組景觀(guān)，并在單細(xì)胞分辨率上揭示了HCC細(xì)胞、MDSCs和CD36+ CAFs之間的相互作用。CD36+ CAFs表現(xiàn)出高水平的脂質(zhì)代謝和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)表達(dá)，CD36+CAFs來(lái)源于肝星狀細(xì)胞。此外，CD36在CD36+ CAFs中通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化/p38/CEBPs軸介導(dǎo)氧化性L(fǎng)DL攝取依賴(lài)的MIF表達(dá)，CD36+ CAFs以MIF和cd74依賴(lài)的方式招募CD33+MDSCs。CD36+ CAFs與HCC細(xì)胞共植入促進(jìn)HCC在體內(nèi)的進(jìn)展。最后，CD36抑制劑與抗PD-1免疫治療協(xié)同作用，通過(guò)恢復(fù)HCC中的抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)。
