今天跟大家分享的是2020年4月發(fā)表在frontiers in oncology上的一篇文章，影響因子4.137。這是一篇腫瘤微環(huán)境：基質(zhì)+免疫+ESTIMATE評(píng)分的文章，之前也分享過類似的文章哦，看來這個(gè)思路還是蠻值得借鑒的嘛。BTK Has Potential to Be a Prognostic Factor for Lung Adenocarcinoma and an Indicator for Tumor Microenvironment Remodeling: A Study Based on TCGA Data MiningBTK有可能成為肺腺癌的預(yù)后因素和腫瘤微環(huán)境重塑的指標(biāo)：一項(xiàng)基于TCGA數(shù)據(jù)挖掘的研究腫瘤微環(huán)境（TME）在肺腺癌（LUAD）的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。然而，在理解TME中免疫和基質(zhì)成分的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)方面仍然存在挑戰(zhàn)。該項(xiàng)研究基于基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分共同篩選與肺腺癌免疫浸潤的預(yù)后因子，并用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其表達(dá)。先介紹下文章使用的數(shù)據(jù)和方法吧。作者從TCGA數(shù)據(jù)庫下載了551例LUAD病例的轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)（正常樣品54例;腫瘤樣品497例）和相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)。1.2 ImmuneScore，StromalScore和ESTIMATEScore的生成作者使用R語言estimate包中的ESTIMATE算法來估計(jì)每個(gè)樣本在TME中的免疫基質(zhì)成分的比率，以三種得分的形式展現(xiàn)：ImmuneScore，StromalScore和 ESTIMATEScore，分別與免疫，基質(zhì)和兩者之和呈正相關(guān)，這意味著相應(yīng)分?jǐn)?shù)越高，TME中相應(yīng)成分的比率就越大。使用R包survminer進(jìn)行生存分析，用Kaplan–Meier方法繪制生存曲線，將對數(shù)秩作為統(tǒng)計(jì)顯著性檢驗(yàn)。1.4在ImmuneScore和StromalScore的高分和低分組之間生成DEG作者分別根據(jù)與ImmuneScore和StromalScore的中位數(shù)，將497個(gè)腫瘤樣本分為高分組和低分組。使用R包limma進(jìn)行差異表達(dá)分析。使用clusterProfiler，richplot和ggplot2軟件包，對 379個(gè)DEG進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。從TCGA中下載LUAD樣品的臨床病理特征數(shù)據(jù)。使用R語言進(jìn)行分析，取決于比較的臨床分期數(shù)，使用Wilcoxon秩和或Kruskal–Wallis秩和檢驗(yàn)作為顯著性檢驗(yàn)。1.8 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，然后使用Cytoscape進(jìn)行重構(gòu)。應(yīng)用R語言進(jìn)行單變量COX回歸分析。作者從Molecular Signatures數(shù)據(jù)庫下載了Hallmark和C7基因集集合，進(jìn)行GSEA分析。使用CIBERSORT計(jì)算方法估算所有腫瘤樣本中的TIC豐度分布，然后進(jìn)行質(zhì)量過濾，僅選擇421個(gè)p <0.05的腫瘤樣本進(jìn)行以下分析。
為了建立估計(jì)的免疫和基質(zhì)的比例與存活率的相關(guān)性，分別對ImmuneScore，StromalScore和ESTIMATEScore進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析。ImmuneScore 或StromalScore的評(píng)分越高，說明TME中的免疫或基質(zhì)成分越多。ESTIMATEScore是ImmuneScore和StromalScore的總和，表示TME中兩種成分的綜合比例。如圖2A所示，免疫成分的比例與總生存率呈正相關(guān)。盡管StromalScore與總生存率無顯著相關(guān)性（圖2B），但ESTIMATEScore仍與生存率呈正相關(guān)（圖2C）。這些結(jié)果表明，TME中的免疫成分更適合于指示LUAD患者的預(yù)后。
圖2.分?jǐn)?shù)與LUAD患者生存率的相關(guān)性2.3分?jǐn)?shù)與LUAD患者的臨床病理分期有關(guān)為了確定免疫和基質(zhì)成分的比例與臨床病理特征之間的關(guān)系，作者從TCGA數(shù)據(jù)庫中分析了LUAD病例的相應(yīng)臨床信息。結(jié)果顯示，ImmuneScore與TMN期的T分類呈負(fù)相關(guān)（圖3D）；StromalScore僅與TMN期的M分類負(fù)相關(guān)（圖3H），而ESTIMATEScore隨TMN期的增加顯著下降（圖3F和圖3I）。這些結(jié)果表明免疫和基質(zhì)成分的比率與LUAD的進(jìn)展有關(guān)，例如侵襲和轉(zhuǎn)移。
圖3. ImmuneScore和StromalScore與臨床病理分期特征的相關(guān)性2.4 ImmuneScore和StromalScore共同的DEG主要表現(xiàn)為免疫相關(guān)基因的富集為了確定TME中與免疫和基質(zhì)成分有關(guān)的基因表達(dá)譜的確切變化，對高分和低分的樣本進(jìn)行了差異分析。從ImmuneScore（高分與低分樣本）中獲得了總共776個(gè)DEG，626基因上調(diào)，而150個(gè)基因下調(diào)（圖4A，C，D）。同樣，從StromalScore獲得了783個(gè)DEG，由665個(gè)上調(diào)基因和118個(gè)下調(diào)基因組成（圖4B–D）。Venn圖顯示，ImmuneScore和StromalScore中共有317個(gè)高分共享的上調(diào)基因，還有62個(gè)低分共享的下調(diào)基因。這些DEG（共379個(gè)基因）可能是TME狀態(tài)的決定因素。接下來的GO富集分析的結(jié)果表明，DEG與免疫相關(guān)的術(shù)語相關(guān)（圖4E）。KEGG富集分析還顯示這些基因還富集于趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)通路，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和造血細(xì)胞譜系（圖4F）。因此，DEG與免疫相關(guān)，這意味著免疫因子的參與是LUAD中TME的主要特征。
圖4. DEG的熱圖，維恩圖以及GO和KEGG的富集分析2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)與單變量COX回歸的相交分析為了進(jìn)一步探討其潛在機(jī)制，作者使用Cytoscape軟件在STRING數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)。379個(gè)基因之間的相互作用顯示在圖5A中，條形圖表示了按結(jié)點(diǎn)數(shù)排名的前30個(gè)基因（圖5B）。接下來作者進(jìn)行了LUAD患者生存率的單變量COX回歸分析（圖5C）。然后，作者對PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)與按單變量COX回歸p值排序的前16個(gè)因子進(jìn)行交叉分析，僅CCR2和BTK兩個(gè)因子與上述分析重疊（圖5D）。
圖5. 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和單變量COX2.6 LUAD患者BTK表達(dá)與TNM分期及生存率的關(guān)系在這一部分，作者根據(jù)BTK中值表達(dá)將所有LUAD樣本分為BTK高表達(dá)組和BTK低表達(dá)組。生存分析表明，高表達(dá)BTK的LUAD患者比低表達(dá)BTK的患者具有更長的生存期（圖6C）。接下來作者進(jìn)行了結(jié)合臨床特征的BTK分析，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)表明，腫瘤樣本中BTK的表達(dá)明顯低于正常樣本中的表達(dá)（圖6A）。并且在同一患者的正常組織與腫瘤組織之間的配對分析中觀察到了相似的結(jié)果（圖6B）。這些結(jié)果表明，TME中BTK的表達(dá)與LUAD患者的預(yù)后呈正相關(guān)。尤其是，隨著TNM分期的進(jìn)展，BTK的表達(dá)下降（圖6D-G）。
圖6. BTK在樣本中的差異表達(dá)及其與LUAD患者的生存和臨床病理分期特征的關(guān)系
2.7 BTK有可能成為TME調(diào)制的指標(biāo)由于BTK的水平與LUAD患者的生存期和TNM分期呈負(fù)相關(guān)，作者進(jìn)行了GSEA分析，結(jié)果顯示BTK高表達(dá)組的基因主要富集免疫相關(guān)活性（圖7A），對于BTK低表達(dá)組，主要富集的是代謝通路，包括糖酵解，氧化磷酸化和典型的腫瘤通路（圖7B）。對于MSigDB定義的C7集合，免疫基因集、多個(gè)免疫功能基因集在高BTK表達(dá)組中富集（圖7C）。但是，在低BTK表達(dá)組中，幾乎沒有基因集富集（圖7D）。這些結(jié)果表明BTK可能是TME狀態(tài)的一個(gè)潛在指標(biāo)。
圖7.高BTK表達(dá)和低表達(dá)的樣本的GSEA分析為了進(jìn)一步證實(shí)BTK表達(dá)與免疫微環(huán)境的相關(guān)性，作者使用CIBERSORT算法分析了腫瘤浸潤免疫亞群的比例，并在LUAD樣本中構(gòu)建了21種免疫細(xì)胞譜（圖8）。
圖8. 腫瘤樣本中的TIC概況和相關(guān)性分析差異和相關(guān)性分析的結(jié)果表明，總共有8種TIC與BTK的表達(dá)相關(guān)（圖9）。其中5種TICs與BTK表達(dá)呈正相關(guān)，三種TICs與BTK表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了BTK的水平影響TME的免疫活性。
圖9. TICs比例與BTK表達(dá)的相關(guān)性
好啦，文章的思路跟之前發(fā)的文章還是很像的，結(jié)果得到了分析上和實(shí)驗(yàn)上的驗(yàn)證，是一篇典型的干濕結(jié)合的研究。今天的分享到這里就結(jié)束了，感興趣的小伙伴要好好學(xué)習(xí)哦~
