鑒定透明細(xì)胞腎癌的9種關(guān)鍵基因和小分子藥物Identification of 9 key genes and small molecule drugs in clear cell renal cell carcinoma腎細(xì)胞癌是常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤的3％，透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）是腎細(xì)胞癌最常見(jiàn)的亞型。研究通過(guò)加權(quán)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析鑒定和驗(yàn)證與ccRCC腫瘤中的腫瘤發(fā)生和進(jìn)展顯著相關(guān)的關(guān)鍵基因，進(jìn)一步篩選相關(guān)的小分子靶向藥物，可以為ccRCC腫瘤靶向治療提供指導(dǎo)。在數(shù)據(jù)預(yù)處理和質(zhì)量評(píng)估之后，獲得三種表達(dá)譜的表達(dá)矩陣GSE36895，GSE53757和GSE66272。根據(jù)閾值在三種表達(dá)譜中篩選所有差異表達(dá)的基因。三個(gè)數(shù)據(jù)集的DEG顯示為圖1A-1C中的火山圖。在重疊后，鑒定了共同的1387基因，包括673個(gè)上調(diào)基因和714個(gè)下調(diào)基因（圖1D-1E）。
圖1.三個(gè)數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)的基因和常見(jiàn)的差異表達(dá)基因
加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵模塊識(shí)別WGCNA構(gòu)建的輸入數(shù)據(jù)集由GSE66272中常見(jiàn)的1387基因和26個(gè)具有病理分期分級(jí)的ccRCC樣品組成。在R中使用WGCNA包，對(duì)GSE66272的表達(dá)矩陣進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估后，選擇β= 8確保無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)。然后將MEDissThres設(shè)置為0.25合并相似模塊，共識(shí)別出7個(gè)模塊（圖2A-2B）。
圖2. WGCNA共表達(dá)模塊的構(gòu)建
模塊的交互關(guān)系和關(guān)鍵模塊的識(shí)別通過(guò)熱圖分析7個(gè)模塊的交互關(guān)系（圖3A），結(jié)果顯示了這些模塊之間的高度獨(dú)立程度和每個(gè)模塊中基因表達(dá)的獨(dú)立性。然后計(jì)算所有模塊的特征基因，根據(jù)相關(guān)性進(jìn)行聚類。模塊特征基因樹狀圖和熱圖顯示6個(gè)模塊主要分為兩組（圖3B）。藍(lán)色模塊的ME顯示藍(lán)色模塊與其他模塊相比與ccRCC腫瘤階段和等級(jí)顯著相關(guān)（圖3C）。選擇藍(lán)色模塊進(jìn)行后續(xù)分析，并確定藍(lán)色模塊與臨床特征之間的相關(guān)性。
圖3.與臨床特征相關(guān)的模塊的識(shí)別
對(duì)上述藍(lán)色模塊進(jìn)行基因本體分析和KEGG通路富集，結(jié)果表明藍(lán)色模塊中的基因主要與細(xì)胞分裂，細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期和代謝相關(guān)（圖4A）。KEGG通路富集的結(jié)果顯示在圖4B中，最重要的通路是細(xì)胞周期。
基于cor.geneModuleMembership> 0.8和cor.geneTraitSignificance> 0.2的標(biāo)準(zhǔn)，將藍(lán)色模塊中具有高連接性的25個(gè)基因篩選為hub基因（圖3D），然后使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的ccRCC數(shù)據(jù)驗(yàn)證25個(gè)hub基因。其中，PTTG1，RRM2，TOP2A，UHRF1，CEP55，BIRC5，UBE2C，F(xiàn)OXM1和CDC20與ccRCC患者的OS和DFS呈負(fù)相關(guān)（圖5,6）?；贕EPIA數(shù)據(jù)庫(kù)和Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)，與癌旁正常組織相比，這9種基因的表達(dá)水平在ccRCC腫瘤組織中顯著更高（圖7）。在癌癥本身分析，這9種基因的表達(dá)在晚期腫瘤階段中顯著上調(diào)。與Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)的癌旁正常組織相比，這9種基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平在腫瘤組織中顯著更高。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)生成ROC曲線以驗(yàn)證這9種基因的診斷性能，AUC顯示PTTG1，RRM2，TOP2A，UHRF1，CEP55，BIRC5，UBE2C，F(xiàn)OXM1和CDC20對(duì)腫瘤和正常組織顯示出優(yōu)異的診斷效率（圖8）。為了進(jìn)一步評(píng)估否能夠提供有利的預(yù)后價(jià)值，進(jìn)行多變量Cox回歸分析。表1中的結(jié)果顯示基于這9個(gè)基因特征的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是ccRCC患者臨床上獨(dú)立的預(yù)后因素。
圖5. ccRCC中9個(gè)關(guān)鍵基因的總體存活分析（基于GEPIA中的TCGA數(shù)據(jù)）
圖6.CCRCC中9個(gè)關(guān)鍵基因的無(wú)病生存分析（基于GEPIA中的TCGA數(shù)據(jù)） 
圖7.GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中正常腎和ccRCC組織之間PTTG1，RRM2，TOP2A，UHRF1，CEP55，BIRC5，UBE2C，F(xiàn)OXM1和CDC20的基因表達(dá)水平的驗(yàn)證
圖8. 9個(gè)關(guān)鍵基因診斷的ROC曲線分析
表1.對(duì)ccRCC患者的潛在預(yù)后因素的多變量Cox回歸分析
通過(guò)GSEA探索9個(gè)hub基因的生物學(xué)功能，結(jié)果顯示所有9個(gè)關(guān)鍵基因中的高表達(dá)樣品富含細(xì)胞周期途徑。
使用TCGA ccRCC患者的cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析了9個(gè)關(guān)鍵基因的改變狀態(tài)。在446個(gè)ccRCC患者的118個(gè)中，9個(gè)hub基因發(fā)生了改變（圖9B），每個(gè)hub基因的改變?nèi)鐖D9A所示。PTTG1和FOXM1改變最多，主要類型是擴(kuò)增和mRNA上調(diào)。圖9C顯示了9種基因與其他50種最常更改的鄰近基因的關(guān)系。
圖9.與9個(gè)關(guān)鍵基因相關(guān)的遺傳改變
為了鑒定候選的治療ccRCC的小分子，用CMap數(shù)據(jù)庫(kù)篩選小分子藥物。根據(jù)分析ccRCC樣本和相鄰正常樣本之間一致的不同表達(dá)的探針組，確定了具有高度顯著相關(guān)性的相關(guān)小分子藥物。按實(shí)例數(shù)（n> 10）和P值（<0.05）過(guò)濾10種小分子藥物（表2）。在這些小分子藥物中，曲古抑菌素A（TSA），三氟拉嗪，染料木黃酮和丙氯拉嗪顯示出更高的負(fù)相關(guān)性和治療ccRCC的潛力。
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