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近日，Nature子刊npj Precision Oncology（IF：10.092）發(fā)表了一篇文章，作者使用了三種EML4-ALK肺癌小鼠模型來(lái)測(cè)試宿主免疫在阿來(lái)替尼治療反應(yīng)中的作用。μCT連續(xù)測(cè)定腫瘤體積，流式細(xì)胞術(shù)和多譜免疫熒光法測(cè)定免疫細(xì)胞含量。通過(guò)RNA-seq評(píng)估對(duì)阿來(lái)替尼的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并通過(guò)ELISA檢測(cè)分泌趨化因子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持適應(yīng)性免疫在TKI反應(yīng)持久性中的作用，并證明腫瘤微環(huán)境的免疫細(xì)胞組成可預(yù)測(cè)對(duì)阿來(lái)替尼治療的反應(yīng)。
含有致癌EML4-ALK融合的肺癌對(duì)靶向酪氨酸激酶抑制劑(TKIs;例如，阿萊克替尼)，收縮程度和治療時(shí)間(DOT)有所不同。然而，控制這種反應(yīng)的因素還沒(méi)有得到很好的理解。雖然免疫系統(tǒng)在介導(dǎo)免疫治療反應(yīng)中的作用已被廣泛研究，但關(guān)于免疫對(duì)TKI治療反應(yīng)的作用尚不清楚。之前已經(jīng)證明了TKI誘導(dǎo)的IFNγ轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與EGFR突變肺癌中的DOT呈正相關(guān)。事實(shí)上，越來(lái)越多的文獻(xiàn)支持宿主免疫細(xì)胞在精確腫瘤藥物和細(xì)胞毒性藥物的整體治療反應(yīng)中的作用。然而，TKIs誘導(dǎo)因子介導(dǎo)旁分泌信號(hào)傳遞到免疫微環(huán)境的機(jī)制以及對(duì)整體治療反應(yīng)的貢獻(xiàn)尚不清楚。臨床前小鼠模型概括了人類(lèi)疾病的關(guān)鍵特征，為深入的機(jī)制探索開(kāi)辟了道路。
注入Adeno-Cas9-gRNA病毒在C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)了多個(gè)腫瘤病灶。絕大多數(shù)病灶在阿來(lái)替尼治療后迅速而顯著地縮小。此外，TKI治療4周后終止治療導(dǎo)致部分(但不是全部)病變?cè)?周內(nèi)迅速再生，這表明存在殘留疾病。因此，EML4-ALK驅(qū)動(dòng)的肺癌小鼠模型和人類(lèi)疾病一樣表現(xiàn)力對(duì)治療反應(yīng)的異質(zhì)性。為了進(jìn)一步研究介導(dǎo)反應(yīng)深度和持續(xù)時(shí)間變化的分子機(jī)制，開(kāi)發(fā)了一組來(lái)自該模型的可移植小鼠EML4-ALK癌細(xì)胞系。
小鼠ALK+細(xì)胞系被稱為EA2，還開(kāi)發(fā)了另外兩種EML4-ALK驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞系，EA1和EA3。從C57BL/6小鼠中分離出所有細(xì)胞系。EA2和EA3細(xì)胞系來(lái)源于TP53缺失小鼠，而EA1細(xì)胞系來(lái)源于TP53野生型小鼠。這三種細(xì)胞系對(duì)ALK TKIs、阿來(lái)替尼和lorlatinib表現(xiàn)出體外生長(zhǎng)敏感性(圖1a)。阿來(lái)替尼可等效地降低MAPK通路調(diào)控基因ETV4、ETV5、FOSL1和DUSP6的mRNA水平（圖1b）。這表明EA1，EA2和EA3細(xì)胞在體外功能試驗(yàn)中對(duì)阿來(lái)替尼的敏感性相同。
用三株EML4-ALK細(xì)胞系在同基因C57BL/6小鼠左肺葉建立原位腫瘤。腫瘤形成約10~14天后，用μCT測(cè)量初始腫瘤體積，每天口服阿來(lái)替尼或灌胃稀釋劑，每周測(cè)量腫瘤體積。在所有三個(gè)模型中，阿來(lái)替尼使腫瘤顯著縮小(圖2a)。通過(guò)μCT成像，在治療2周后，患者的DepOR達(dá)到了最大(圖3a)。EA2的DepOR最大，其次是EA3，EA1腫瘤收縮最小。3周后，停用阿來(lái)替尼，EA1和EA3荷瘤小鼠的腫瘤迅速進(jìn)展，殘留病變明顯，而EA2荷瘤小鼠則沒(méi)有(圖3b)。因此，3-4周的TKI治療可產(chǎn)生不同程度的殘余疾病。
為了測(cè)試適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在阿來(lái)替尼治療反應(yīng)中的作用，將小鼠EML4-ALK細(xì)胞接種到缺乏功能性T和B細(xì)胞的nu/nu小鼠的左肺中。在所有三個(gè)EML4-ALK細(xì)胞系模型中，開(kāi)始治療后的3~4周內(nèi)，腫瘤出現(xiàn)了顯著的縮小(圖2b)。EA2細(xì)胞也接種到免疫缺陷的Rag1?/?小鼠的原位位置。腫瘤短暫收縮，但腫瘤在開(kāi)始治療的3周內(nèi)發(fā)生進(jìn)展。這些數(shù)據(jù)表明，功能性適應(yīng)性免疫細(xì)胞對(duì)于阿來(lái)替尼的持續(xù)抗癌活性至關(guān)重要。在免疫功能正常的小鼠中，EA2和EA3腫瘤的收縮程度更大，而在nu/nu宿主中繁殖的EA1腫瘤，阿來(lái)替尼誘導(dǎo)的收縮程度沒(méi)有差異(圖3c)。因此，適應(yīng)性免疫有助于在阿來(lái)替尼反應(yīng)的深度和持久性。
以上結(jié)果支持腫瘤微環(huán)境在介導(dǎo)TKI治療反應(yīng)中的作用。為了分析對(duì)照組和經(jīng)阿來(lái)替尼治療的腫瘤的免疫細(xì)胞群，采用對(duì)阿來(lái)替尼表現(xiàn)出部分反應(yīng)的EA1模型和表現(xiàn)出完全反應(yīng)的EA2模型。將EA1和EA2細(xì)胞植入小鼠體內(nèi)，培養(yǎng)3周，然后用對(duì)照組或阿來(lái)替尼處理4天。采集患有EA1和EA2腫瘤的C57BL/6小鼠的左肺，并使用多光譜成像(Polaris Vectra)。在未治療的腫瘤中，與EA1相比，EA2腫瘤中觀察到腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+細(xì)胞數(shù)量顯著增加，CD3+ CD8?細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)(圖4a)。阿來(lái)替尼治療后，EA2腫瘤的CD8+T細(xì)胞含量有增加趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；EA1腫瘤的CD8+或CD4+T細(xì)胞含量無(wú)變化。對(duì)照組EA1和EA2腫瘤的B細(xì)胞含量相似，在阿來(lái)替尼治療后沒(méi)有變化(圖4a)。
為了識(shí)別髓系細(xì)胞類(lèi)型的潛在變化，使用流式細(xì)胞術(shù)。EA1和EA2荷瘤小鼠肺中單核細(xì)胞(CD11b+/Ly6C+)含量無(wú)差異(圖4b)。與EA1腫瘤相比，對(duì)照組EA2腫瘤的肺泡巨噬細(xì)胞(MacA：CD11c+/SigF+)和招募單核/巨噬細(xì)胞群(MacB：CD11b+/Ly6G?/SigF?)含量增加，阿來(lái)替尼治療后，MacA細(xì)胞含量降低(圖4b)。相比之下，與EA2腫瘤相比，對(duì)照組EA1腫瘤的中性粒細(xì)胞(CD11b+/Ly6G+/SigF?)含量升高，而阿來(lái)替尼誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞數(shù)量減少，接近統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4b)。
最近的研究表明，TKI刺激的IFNγ轉(zhuǎn)錄反應(yīng)伴隨著趨化因子表達(dá)的增加。三株小鼠EML4-ALK細(xì)胞系在體外用阿來(lái)替尼或DMSO處理，并進(jìn)行RNA-seq，然后使用GSEA分析。數(shù)據(jù)顯示，多種炎癥相關(guān)的Hallmark通路在阿來(lái)替尼處理的細(xì)胞中富集，與細(xì)胞增殖相關(guān)的Hallmark通路在阿來(lái)替尼處理的細(xì)胞中顯著去富集，并進(jìn)一步支持阿來(lái)替尼在三種細(xì)胞系中的等效生長(zhǎng)抑制作用。
為了探究EML4-ALK系作為原位腫瘤繁殖時(shí)趨化因子表達(dá)的多樣性，從未處理的EA1和EA2腫瘤中純化出轉(zhuǎn)基因GFP表達(dá)小鼠的癌細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq分析。如圖5所示，CXCL9和CXCL10這兩種具有T細(xì)胞募集功能的趨化因子在EA2腫瘤中的mRNA水平明顯高于EA1。與EA1腫瘤相比，未治療的EA2腫瘤中CCL2和CCL7的表達(dá)也更高。相比之下，與招募免疫抑制相關(guān)的CXCL1、CXCL2、CXCL12和TGF-β2、趨化因子和細(xì)胞因子在EA1腫瘤中的水平高于EA2腫瘤。
特定的趨化因子和細(xì)胞因子是組成炎癥相關(guān)標(biāo)志通路的基因的中心。選擇多個(gè)趨化因子基因，并通過(guò)ELISA檢測(cè)阿來(lái)替尼治療對(duì)其分泌的影響。圖6揭示了阿來(lái)替尼刺激分泌多種不同活性的趨化因子，作為抗腫瘤因子和促腫瘤因子。在EA2和EA3細(xì)胞中，CXCL10和CCL5對(duì)阿來(lái)替尼的反應(yīng)顯著，但在EA1細(xì)胞中反應(yīng)弱。相比之下，阿來(lái)替尼誘導(dǎo)的CXCL1、CXCL5和CCL2分泌在骨髓系淋巴細(xì)胞募集中的作用在三種細(xì)胞系中相似。一般來(lái)說(shuō)，在體外未處理的細(xì)胞系中檢測(cè)到的趨化因子表達(dá)水平非常低，這表明來(lái)自小鼠宿主的信號(hào)被EA1和EA2細(xì)胞明顯整合，以達(dá)到在體內(nèi)觀察到的不同水平。
為了探索宿主免疫微環(huán)境與患者ALK靶向TKI反應(yīng)的相關(guān)性，從14例ALK+患者中獲得了在診斷LUAD時(shí)和TKI治療前的活檢標(biāo)本的H&E染色切片。所有患者接受TKI治療。淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞（PMNs）在腫瘤和間質(zhì)室中被定量。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)和PMN的代表性圖像如圖7a, b所示。結(jié)果值與患者的PFS進(jìn)行Spearman相關(guān)性。PFS與PMN總含量及總PMN與總淋巴細(xì)胞之比呈負(fù)相關(guān)，而與間質(zhì)、瘤內(nèi)或總淋巴細(xì)胞含量無(wú)顯著相關(guān)性(圖7c)。結(jié)果表明，高PMN含量與TKI反應(yīng)持續(xù)時(shí)間縮短有關(guān)。
在這篇文章中，作者使用了三種EML4-ALK肺癌小鼠模型來(lái)測(cè)試宿主免疫在阿來(lái)替尼治療反應(yīng)中的作用。細(xì)胞系(EA1，EA2，EA3)在免疫功能正常和免疫缺陷小鼠的肺中原位繁殖，并用阿來(lái)替尼處理。μCT連續(xù)測(cè)定腫瘤體積，流式細(xì)胞術(shù)和多譜免疫熒光法測(cè)定免疫細(xì)胞含量。通過(guò)RNA-seq評(píng)估對(duì)阿來(lái)替尼的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并通過(guò)ELISA檢測(cè)分泌趨化因子。所有細(xì)胞系在體外和免疫能力小鼠的原位腫瘤中對(duì)阿來(lái)替尼同樣敏感，表現(xiàn)出持久的收縮。然而，在免疫缺陷小鼠中，所有腫瘤模型在TKI治療后迅速進(jìn)展。在具有免疫功能的小鼠中，EA2腫瘤表現(xiàn)出完全緩解，而EA1和EA3腫瘤保留了殘余疾病，并在TKI治療終止后迅速進(jìn)展。治療前，與EA1腫瘤相比，EA2腫瘤具有更多數(shù)量的CD8+ T細(xì)胞和更少的中性粒細(xì)胞。此外，從未經(jīng)治療的腫瘤中恢復(fù)的癌細(xì)胞的RNA-seq顯示，EA2腫瘤中CXCL9和10水平升高，EA1腫瘤中CXCL1和2水平升高。對(duì)ALK+腫瘤患者治療前活檢的分析顯示，中性粒細(xì)胞含量與較短的進(jìn)展時(shí)間有關(guān)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)支持適應(yīng)性免疫在TKI反應(yīng)持久性中的作用，并證明腫瘤微環(huán)境的免疫細(xì)胞組成可預(yù)測(cè)對(duì)阿來(lái)替尼治療的反應(yīng)。
