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哈嘍，各位guys，大家早上好。大早上的你是不是和小編一樣，在睡眼朦朧，昏昏欲睡呢？那就趕快和小編一起來(lái)篇文章提提神吧。今天小編想和大家分享的是一篇來(lái)自于nature biotechnology（IF=54.908）的綜述文章，該工作對(duì)現(xiàn)有COVID-19相關(guān)單細(xì)胞組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，并匯總現(xiàn)有結(jié)論和研究成果，對(duì)單細(xì)胞免疫分析和COVID-19間關(guān)聯(lián)進(jìn)行整合。
自2019年底COVID-19被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，當(dāng)前全球累計(jì)確診新冠肺炎病例已超3.7億例，累計(jì)死亡病例超過(guò)560萬(wàn)病例，嚴(yán)重危害全球公眾健康，對(duì)全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成極大的沖擊和破壞。2020年全球GDP下降4.9％，許多發(fā)展中國(guó)家的GDP甚至出現(xiàn)兩位數(shù)的下降（我國(guó)除外）。此外，從長(zhǎng)期來(lái)看，COVID-19對(duì)環(huán)境、社會(huì)和治理等方面的影響在一段時(shí)間內(nèi)將持續(xù)存在。生產(chǎn)率增長(zhǎng)的急劇下降，不平等程度的加劇，生物多樣性的崩潰等，都是未來(lái)需要優(yōu)先關(guān)注的重點(diǎn)。此外，盡管許多 COVID-19患者表現(xiàn)為無(wú)癥狀或僅出現(xiàn)輕度，中度癥狀，但有些患者仍會(huì)發(fā)展為嚴(yán)重疾病甚至死亡。另外，部分COVID-19痊愈者更是面臨長(zhǎng)期的后續(xù)健康問(wèn)題，包括疲倦、呼吸急促、認(rèn)知問(wèn)題、嗅味覺(jué)失靈、肌肉無(wú)力和心悸等。
深入認(rèn)識(shí)了解新冠肺炎發(fā)病機(jī)理，挖掘控制新冠流行的疾病機(jī)制對(duì)其診療與防控具有重要意義。多項(xiàng)研究表明免疫反應(yīng)的改變是導(dǎo)致COVID-19患者出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀的關(guān)鍵機(jī)制之一。因此，更好地了解與SARS-CoV-2保護(hù)性或病理性免疫相關(guān)的免疫細(xì)胞亞群和分子，有助于開發(fā)COVID-19的疫苗和治療方法。單細(xì)胞技術(shù)，如流式細(xì)胞術(shù)、大規(guī)模細(xì)胞術(shù)、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞多組學(xué)分析，為解剖單個(gè)細(xì)胞間免疫應(yīng)答的異質(zhì)性和揭示COVID-19發(fā)病機(jī)制的分子機(jī)制提供很大希望，在探究病毒感染及傳播途徑、加速臨床中和抗體篩選等諸多方面助力新冠肺炎的防控。已經(jīng)報(bào)道的單細(xì)胞免疫圖譜研究已經(jīng)確定與COVID-19疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的固有和適應(yīng)性免疫細(xì)胞亞群，以及與COVID-19疫苗和治療方法開發(fā)潛在相關(guān)的免疫因子和免疫通路。然而，現(xiàn)階段還沒(méi)有較為綜合的COVID-19相關(guān)單細(xì)胞組學(xué)分析數(shù)據(jù)庫(kù)。為促進(jìn)對(duì)SARS-CoV-2感染免疫學(xué)的整合研究和meta分析，研究者對(duì)21個(gè)已發(fā)布的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集(超過(guò)320萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行整合概況，提供標(biāo)準(zhǔn)化、可下載版本的數(shù)據(jù)，并構(gòu)建一個(gè)可用于數(shù)據(jù)探索的交互式可視化網(wǎng)站，有助于幫助新冠的診療與防控。
廢話不多說(shuō)，快來(lái)和小編一起開啟今天的學(xué)習(xí)旅程吧。
Single-cell immunology of SARS-CoV-2 infection
SARS-CoV-2感染的單細(xì)胞免疫學(xué)
1. 單細(xì)胞技術(shù)和相關(guān)數(shù)據(jù)集
迄今為止在COVID-19研究中使用的單細(xì)胞技術(shù)，如流式細(xì)胞術(shù)、大規(guī)模細(xì)胞術(shù)、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)等，其中包括62篇已發(fā)表的文章和兩篇預(yù)印本文章對(duì)COVID-19背景下應(yīng)用一項(xiàng)或多項(xiàng)單細(xì)胞技術(shù)的研究（表1）。本研究包括多個(gè)單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集，其研究的樣本量和維度如圖1所示。流式細(xì)胞術(shù)是最常用的單細(xì)胞技術(shù)，但scRNA-seq和單細(xì)胞多組學(xué)分析也得到更多的使用。流式或大規(guī)模細(xì)胞術(shù)對(duì)多達(dá)300個(gè)個(gè)體和多達(dá)62個(gè)標(biāo)記物的一個(gè)或多個(gè)面板的數(shù)據(jù)進(jìn)行研究;54個(gè)數(shù)據(jù)集中有25個(gè)包含縱向數(shù)據(jù)(圖1a)。大多數(shù)單細(xì)胞測(cè)序研究分析來(lái)自少于150個(gè)人的50,000個(gè)細(xì)胞;其中只有少數(shù)包含縱向數(shù)據(jù)(圖1b)
研究者對(duì)64篇文章中通過(guò)單細(xì)胞技術(shù)獲得的關(guān)鍵結(jié)論進(jìn)行簡(jiǎn)要總結(jié)，包括新冠與先天免疫細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞之間的關(guān)系，以及單細(xì)胞數(shù)據(jù)與免疫保護(hù)之間的相關(guān)性進(jìn)行總結(jié)。
表1. 單細(xì)胞技術(shù)在新冠肺炎研究中的應(yīng)用
圖1. 使用一項(xiàng)或多項(xiàng)單細(xì)胞技術(shù)發(fā)表的64篇COVID-19相關(guān)文章的特征展示(2020年3月至2021年3月)
2. 先天免疫反應(yīng)
大多數(shù)基于流式細(xì)胞術(shù)和大規(guī)模細(xì)胞術(shù)的COVID-19患者外周血單核細(xì)胞（PBMCs）分析稱，與健康者相比，循環(huán)嗜堿性粒細(xì)胞單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dc)和自然殺傷細(xì)胞(NK)的豐度降低，重癥COVID-19患者的減少比輕度COVID-19患者的減少更多。相反，與健康獻(xiàn)血者相比，COVID-19患者的循環(huán)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞髓源性抑制細(xì)胞的數(shù)量增加，COVID-19重癥患者的數(shù)量比COVID-19輕癥患者的數(shù)量增加更多。中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比值也被報(bào)道與重癥COVID-19相關(guān)。
NK細(xì)胞：高維流式細(xì)胞術(shù)使免疫細(xì)胞亞群的深入表征成為可能。一份關(guān)于NK細(xì)胞的研究顯示，與健康對(duì)照組相比，COVID-19患者的循環(huán)NK細(xì)胞較少，但高度激活和增殖的NK細(xì)胞更多。重癥COVID-19與循環(huán)適應(yīng)性NK細(xì)胞水平的增加有關(guān)，表明適應(yīng)性和活化的NK細(xì)胞在COVID-19發(fā)病機(jī)制中起作用。scRNA-seq數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步表明在COVID-19中，NK細(xì)胞高度激活。
中性粒細(xì)胞：重癥COVID-19中存在嗜中性粒細(xì)胞胞外陷阱。通過(guò)scRNA-seq和中性粒細(xì)胞顆粒相關(guān)基因的特征性表達(dá)以及典型中性粒細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)缺陷，研究者發(fā)現(xiàn)一個(gè)發(fā)展中的中性粒細(xì)胞亞群，該亞群在急性呼吸窘迫綜合征患者中特異性增加。另一項(xiàng)以scRNA-seq、高維流式細(xì)胞術(shù)和大規(guī)模細(xì)胞術(shù)為基礎(chǔ)的研究報(bào)告稱，重癥COVID-19與循環(huán)中未成熟中性粒細(xì)胞大量增加以及中性粒細(xì)胞簇的出現(xiàn)有關(guān)，中性粒細(xì)胞簇的特征是S100A8和S100A9等基因的上調(diào)。
樹突細(xì)胞（DCs）：一份包含較大樣本量（52名COVID-19患者，62名健康對(duì)照患者）的單細(xì)胞數(shù)據(jù)表明，COVID-19患者血漿細(xì)胞樣DCs (pDCs)數(shù)量減少，這些pDCs中mTOR蛋白表達(dá)減少，提示COVID-19患者血漿細(xì)胞樣DCs可能存在干擾素(IFN)-α信號(hào)缺失。
單核細(xì)胞：在另一項(xiàng)樣本量也相對(duì)較大的數(shù)據(jù)中(53名COVID-19患者、8名流感樣疾病患者和48名健康對(duì)照組)，研究人員使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組(scRNA-seq)和蛋白質(zhì)組(CyTOF)分析測(cè)試不同的先天免疫反應(yīng)是否與COVID-19的臨床進(jìn)展相關(guān)。研究顯示，與健康對(duì)照組相比，輕度COVID-19患者炎癥性HLA-DR-high-CD11c-high-CD14 +單核細(xì)胞水平升高。相反,重癥COVID-19患者不僅可以通過(guò)HLA-DR低表達(dá)的單核細(xì)胞群(提示單核細(xì)胞功能異常)和抗炎巨噬細(xì)胞功能相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)來(lái)區(qū)分，還可以通過(guò)大量不成熟中性粒細(xì)胞表達(dá)免疫抑制或功能障礙標(biāo)志物來(lái)區(qū)分。這些發(fā)現(xiàn)確定單核細(xì)胞反應(yīng)的功能失調(diào)以及骨髓生成的異常是COVID-19進(jìn)展的潛在重要過(guò)程。
通過(guò)單細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行的免疫細(xì)胞表型分析，對(duì)重癥COVID-19與SARS-CoV-2感染相關(guān)的多系統(tǒng)炎癥綜合征(MIS-C)中可能失調(diào)的免疫途徑有更深入的了解。這些了解反過(guò)來(lái)可以針對(duì)具有治療潛力的免疫因素，為目前和未來(lái)的COVID-19抗炎治療策略的發(fā)展提供信息。已有證據(jù)表明這種抗炎治療策略可能有效。此外，流式細(xì)胞術(shù)、大規(guī)模細(xì)胞術(shù)和scRNA-seq檢測(cè)均顯示，在重癥COVID-19患者以及與SARS-CoV-2感染相關(guān)的MIS-C兒童中，單核細(xì)胞HLA-DR和CD86表達(dá)降低意味著抗原向T細(xì)胞遞呈過(guò)程可能受損。單核細(xì)胞HLA-DR的下調(diào)可能是由白細(xì)胞介素(IL)-6驅(qū)動(dòng)的，在重癥COVID-19患者和MIS-C兒童患者中，由于IL -6升高導(dǎo)致的HLA-DR表達(dá)降低，可以通過(guò)Tocilizumab(一種針對(duì)IL-6受體(IL-6R)并阻斷IL-6信號(hào)的人源化免疫球蛋白(Ig)G1κ單克隆抗體)部分恢復(fù)。
Tocilizumab在預(yù)防中度COVID-19患者疾病進(jìn)展，插管或死亡方面沒(méi)有療效；然而，后一項(xiàng)研究在療效比較中有很大的置信區(qū)間，另一項(xiàng)報(bào)告表明，Tocilizumab在降低通氣需求和死亡率方面有潛在益處。因此，IL-6R阻斷劑是否能使中度或重度COVID-19患者受益的問(wèn)題仍然懸而未決。其他趨化因子受體阻斷劑也正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)?；贑OVID-19危重或非危重患者鼻咽樣本的scRNA-seq測(cè)序，COVID-19中度或危重患者的鼻咽和支氣管樣本的scRNA-seq數(shù)據(jù)分析表明趨化因子受體CCR1也被識(shí)別為潛在的治療靶點(diǎn)。
巨噬細(xì)胞：對(duì)氣道和肺泡細(xì)胞的多項(xiàng)單細(xì)胞研究揭示巨噬細(xì)胞在COVID-19中的作用，特別是巨噬細(xì)胞反應(yīng)失調(diào)可能導(dǎo)致病理性炎癥。危重型COVID-19患者表現(xiàn)為上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間配體受體相互作用增加，非resident巨噬細(xì)胞中促炎趨化因子和細(xì)胞因子基因上調(diào)，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞中CCR1上調(diào)。以上發(fā)現(xiàn)表明，肺部免疫細(xì)胞招募周期(分化為炎性巨噬細(xì)胞的單核細(xì)胞，進(jìn)一步招募和激活更多的免疫細(xì)胞)對(duì)重癥COVID-19中觀察到的上皮損傷的影響。對(duì)BALF細(xì)胞的scRNA-seq分析顯示，支氣管肺泡巨噬細(xì)胞的比例以及炎癥細(xì)胞因子和趨化因子受體的水平與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。重癥COVID-19的巨噬細(xì)胞還表現(xiàn)為FCN1和SPP1的高表達(dá)，提示肺泡巨噬細(xì)胞可能驅(qū)動(dòng)重癥COVID-19患者的局部炎癥反應(yīng)。最后，SARS-CoV-2感染引起的肺炎患者BALF細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)和scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示，肺泡腔內(nèi)存在高水平的單核細(xì)胞以及CD4+和CD8+ T細(xì)胞。scRNA-seq在SARS-CoV-2感染引起的肺炎患者的T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)多個(gè)與組織駐留的肺泡巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞來(lái)源的肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)應(yīng)的簇，以及IFNG的表達(dá)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分類的肺泡巨噬細(xì)胞批量測(cè)序識(shí)別IFN反應(yīng)特征，并在肺泡巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 RNA，表明SARS-CoV-2可以在肺泡巨噬細(xì)胞中復(fù)制，這支持嚴(yán)重COVID-19時(shí)激活的T細(xì)胞釋放IFN-γ的假說(shuō)。反過(guò)來(lái)，這種IFN-γ驅(qū)動(dòng)肺泡巨噬細(xì)胞中的IFN反應(yīng)，導(dǎo)致單核細(xì)胞來(lái)源的肺泡巨噬細(xì)胞的招募，完成炎癥信號(hào)循環(huán)。
另一項(xiàng)來(lái)自于四個(gè)健康的捐贈(zèng)者,5名流感感染患者和名8 COVID-19患者PBMCs的RNA-seq分析表明，基于IFN-I相關(guān)轉(zhuǎn)錄特征和相關(guān)炎性轉(zhuǎn)錄特征可以區(qū)分重癥患者的單核細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)表明IFN-I反應(yīng)有助于增加嚴(yán)重COVID-19的有害炎癥的假設(shè)。
3. B細(xì)胞反應(yīng)
中和抗體(nAbs)在預(yù)防SARS-CoV-2感染和COVID-19疾病中有著重要的作用，因此，人們對(duì)識(shí)別針對(duì)SARS-CoV-2的有效nAbs產(chǎn)生濃厚的興趣。由于B細(xì)胞表現(xiàn)出廣泛多變(V)、多樣性(D)和連接(J)基因(VDJ)重組以及體細(xì)胞過(guò)度突變特征，因此這種分析需要單細(xì)胞方法完成。
免疫球蛋白序列：識(shí)別相關(guān)抗體序列的一般策略是通過(guò)scRNA-seq對(duì)COVID-19恢復(fù)期個(gè)體的抗原特異性記憶B細(xì)胞進(jìn)行排序和加工。單細(xì)胞水平的VDJ測(cè)序(scVDJ-seq34)已識(shí)別出對(duì)SARS-CoV-2具有預(yù)防或治療效果的nAb，為nAb臨床試驗(yàn)提供有效幫助。
在一項(xiàng)采用高通量scRNA VDJ-seq的研究中，識(shí)別出約9000個(gè)RBD結(jié)合的B細(xì)胞克隆型，產(chǎn)生14個(gè)有效的單克隆抗體，其中一個(gè)在小鼠模型中被證明可以防止SARS-CoV-2感染。耦合的scRNA-seq數(shù)據(jù)允許識(shí)別原始B細(xì)胞和記憶B細(xì)胞的子集，并通過(guò)過(guò)濾出在原始B細(xì)胞和耗竭B細(xì)胞中富集的克隆型，幫助提高nAb的選擇效率。另一項(xiàng)使用scRNA VDJ-seq的研究也鑒定出19個(gè)有效的單克隆抗體，包括RBD結(jié)合的和非RBD結(jié)合的單克隆抗體，其中一個(gè)在倉(cāng)鼠模型中被證明可以預(yù)防SARS-CoV-2。單細(xì)胞功能分析與scVDJ-seq的聯(lián)合應(yīng)用，可以識(shí)別出對(duì)刺突糖蛋白具有不同反應(yīng)性和與SARS-CoV-2具有交叉反應(yīng)性的五類主要單克隆抗體。對(duì)來(lái)自穩(wěn)定的COVID-19患者(住院并最終出院)和進(jìn)展的COVID-19患者(在重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)接受治療并最終死亡)的PBMC來(lái)源單細(xì)胞數(shù)據(jù)的多維整合，包括scRNA-seq和CITE-seq，B細(xì)胞受體(BCR)和T細(xì)胞受體(TCR)測(cè)序等表明COVID-19中存在復(fù)雜的B細(xì)胞應(yīng)答，包括高比例的未突變的Igγ重鏈(IGHG) B細(xì)胞克隆，與多個(gè)突變的B細(xì)胞克隆一起出現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，體細(xì)胞過(guò)度突變水平似乎沒(méi)有增加。后者可能是由于記憶B細(xì)胞與其他冠狀病毒的交叉響應(yīng)未能形成。
B細(xì)胞特征：高維流式細(xì)胞術(shù)已被用于表征和比較不同嚴(yán)重程度的COVID-19患者的B細(xì)胞反應(yīng)。一個(gè)由24 marker組成的特征可用來(lái)識(shí)別B細(xì)胞群體，并評(píng)估其激活狀態(tài)，從而可以識(shí)別濾泡外B細(xì)胞過(guò)度激活與COVID-19疾病嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性。重癥患者的RBD靶向SARS-CoV-2單克隆抗體在血清中濃度較高，也引發(fā)一個(gè)問(wèn)題，即重癥COVID-19患者的這種獨(dú)特的B細(xì)胞反應(yīng)是否無(wú)效，甚至可能具有致病性。其他研究已經(jīng)描述體液免疫反應(yīng)與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。然而，這些正相關(guān)性是否僅僅是因?yàn)槌跏疾《据d量的增加，仍然是一個(gè)懸而未決的問(wèn)題。不同研究報(bào)告具有直接、反向或無(wú)相關(guān)性等不同的結(jié)果。這一差異可能是由于取樣位置，取樣時(shí)間和種群的不同造成的。無(wú)論如何，需要進(jìn)行更多的研究來(lái)發(fā)現(xiàn)感染個(gè)體保護(hù)性和非保護(hù)性體液反應(yīng)的細(xì)胞和分子決定因素。
趨同抗體群(多個(gè)患者共享的vdj高度相似的抗體，通常只構(gòu)成病毒特異性B細(xì)胞應(yīng)答的一小部分)也已被確定，這表明大多數(shù)COVID-19患者對(duì)RBD具有趨同的Ig重鏈，這可能是由于接種RBD疫苗導(dǎo)致的。
B細(xì)胞表型：在一項(xiàng)研究中，研究人員利用RBD四聚體富集和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)罕見(jiàn)的RBD特異性B細(xì)胞進(jìn)行表型分析，對(duì)從輕度癥狀的COVID-19患者中恢復(fù)過(guò)來(lái)的縱向樣本進(jìn)行分析調(diào)查。癥狀出現(xiàn)后1 - 3個(gè)月，RBD特異性記憶B細(xì)胞數(shù)量增加，COVID-19樣本中RBD特異性記憶B細(xì)胞數(shù)量顯著高于健康對(duì)照組。此外，典型的記憶B細(xì)胞表型的數(shù)量也在癥狀出現(xiàn)后1 - 3個(gè)月增加，而Tbet-high記憶B細(xì)胞通常在慢性感染中發(fā)現(xiàn)，保持較低水平。另外，記憶B細(xì)胞可能有助于防止二次感染。
人類組織成像平臺(tái)結(jié)合多色免疫熒光和定量自動(dòng)掃描顯微鏡的多光譜成像，已被用于研究從COVID-19死亡患者尸體中獲得的單細(xì)胞水平的胸椎淋巴結(jié)和脾臟。與需要分離組織的單細(xì)胞方法相比，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以在很大程度上保存組織結(jié)構(gòu)，使研究細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用成為可能。這些患者淋巴結(jié)中生發(fā)中心缺失，同時(shí)淋巴結(jié)和脾臟中中心B細(xì)胞和卵泡輔助T細(xì)胞數(shù)量顯著減少。以上結(jié)果表明，在COVID-19患者(特別是重癥COVID-19患者)中觀察到的漿質(zhì)體比例增加，與抗病毒體液免疫欠佳和疾病相關(guān)。
4. T細(xì)胞響應(yīng)
使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)COVID-19患者外周血單核細(xì)胞的多項(xiàng)研究表明T淋巴細(xì)胞減少。在covid -19相關(guān)的MIS-C患者中也觀察到類似的T細(xì)胞淋巴細(xì)胞減少。雖然有報(bào)道稱，COVID-19患者和流感患者CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量的減少具有相似性，但一些研究人員觀察到，COVID-19患者CD4+ T細(xì)胞數(shù)量的減少比流感患者更多。T細(xì)胞數(shù)量減少也與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，因?yàn)樵贑OVID-19重癥患者與中度或輕度患者，或ICU患者與非ICU患者中，CD4+和CD8+ T細(xì)胞數(shù)量均顯著減少。COVID-19患者中CD4+/CD8+ T細(xì)胞比值提示SARS-CoV-2感染可能會(huì)優(yōu)先影響CD8+ T細(xì)胞。
T細(xì)胞表型：多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)還揭示COVID-19患者出現(xiàn)T細(xì)胞的表型和功能改變，主要包括COVID-19中T細(xì)胞的過(guò)度激活，其出現(xiàn)表達(dá)激活、增殖或耗竭標(biāo)記物的亞群升高。與健康對(duì)照組相比，在COVID-19患者或重癥患者中，活化的(HLA-DR+CD38+、CD38+、HLA-DR+、CD25+CD4+和CD25+CD8+)、增殖的(Ki67+CD8+或Ki67+CD4+)和耗竭的(PD-1+CD8+或PD-1+CD4+、TIGIT+或NKG2A+) T細(xì)胞水平顯著增加。急性COVID-19患者中大多數(shù)活化的CD8+ T細(xì)胞已被證明對(duì)SARS-CoV-2具有特異性。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)可能由于采樣時(shí)間的差異，與健康對(duì)照組相比，流感患者和COVID-19患者中HLA-DR+CD38+活化的CD8+ T細(xì)胞豐度均發(fā)生降低。值得注意的是，對(duì)BALF樣本中CD8+ T細(xì)胞的scRNA-seq和單細(xì)胞TCR測(cè)序(scTCR-seq)分析發(fā)現(xiàn)組織resident記憶T細(xì)胞的特征，以及其與輕度疾病相關(guān)的克隆擴(kuò)展水平增加有關(guān)，而增殖能力的提高與重癥患者相關(guān)。對(duì)COVID-19和神經(jīng)后遺癥(neuro-covid)患者分離的腦脊液白細(xì)胞的scRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組患者相比，表達(dá)耗竭標(biāo)記物的CD4+ T細(xì)胞水平較高。
流式細(xì)胞術(shù)和scRNA-seq也發(fā)現(xiàn)COVID-19中T細(xì)胞分化和細(xì)胞毒性的改變。重癥COVID-19患者中細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞的比例高于健康對(duì)照組，且其細(xì)胞毒性分子表達(dá)增加。細(xì)胞毒性的增加已被認(rèn)為有助于上皮損傷。此外，COVID-19患者外周血中樞記憶CD8+ T細(xì)胞減少，衰老和效應(yīng)記憶CD45RA+CD8+ T細(xì)胞增加，提示向終末分化傾斜。另一項(xiàng)研究中，在COVID-19患者的胸淋巴結(jié)和脾臟解剖組織中，CD4+BCL-6+生發(fā)中心型TFH細(xì)胞數(shù)量顯著減少，同時(shí)濾泡中腫瘤壞死因子(TNF)-α水平升高，1型T輔助(TH1)細(xì)胞數(shù)量增加。這些結(jié)果表明，COVID-19損害TFH細(xì)胞的分化可能導(dǎo)致上述生發(fā)中心的缺失。
T細(xì)胞特異性：通過(guò)多種基于流式細(xì)胞術(shù)的技術(shù)，如細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色、激活誘導(dǎo)的標(biāo)記物分析和主要組織相容性復(fù)合體(MHC)多聚體分析等，在急性COVID-19患者和恢復(fù)期患者中發(fā)現(xiàn)存在尖峰和非尖峰表位的SARS-CoV-2特異性T細(xì)胞，表明感染后會(huì)形成病毒特異性記憶T細(xì)胞。盡管重癥COVID-19患者的SARS-CoV-2特異性T細(xì)胞響應(yīng)總體上比輕癥患者表現(xiàn)出更高的廣度和量級(jí)，但輕癥患者中SARS-CoV-2特異性CD8+ T細(xì)胞的比例高于重癥患者。SARS-CoV-2特異性CD4+ T細(xì)胞主要是TH1細(xì)胞，主要表現(xiàn)為中樞記憶T細(xì)胞表型，而SARS-CoV-2特異性CD8+ T細(xì)胞在效應(yīng)記憶和終末分化效應(yīng)亞群中更豐富。對(duì)SARS-CoV-2響應(yīng)性CD4+ T細(xì)胞的scRNA-seq和scTCR-seq分析顯示， SARS-CoV-2特異性細(xì)胞毒性CD4+ T細(xì)胞和細(xì)胞毒性TFH細(xì)胞增加與疾病嚴(yán)重程度之間存在關(guān)聯(lián)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與疾病嚴(yán)重程度之間存在反向關(guān)聯(lián)。在重癥患者中，SARS-CoV-2響應(yīng)性CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒性和炎癥基因表達(dá)增強(qiáng)，TCR克隆擴(kuò)增水平升高，支持過(guò)度激活的抗原特異性T細(xì)胞與COVID-19發(fā)病機(jī)制相關(guān)。由于體外刺激可以從根本上改變響應(yīng)性T細(xì)胞的基因表達(dá)譜，進(jìn)一步使用MHC多肽和單細(xì)胞測(cè)序的研究可以為SARS-CoV-2特異性T細(xì)胞的表型和功能提供進(jìn)一步的見(jiàn)解。此外，單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)，如轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)單細(xì)胞測(cè)序(scATAC-seq)技術(shù)，可用于研究SARS-CoV-2特異性T細(xì)胞是否保留可能決定其記憶響應(yīng)的表觀遺傳指紋（fingerprints）。
T細(xì)胞對(duì)COVID-19免疫的貢獻(xiàn)：接觸地方性冠狀病毒和交叉響應(yīng)性記憶T細(xì)胞免疫如何塑造對(duì)SARS-CoV-2的免疫應(yīng)答，仍存在許多問(wèn)題。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸收斑點(diǎn)(ELISpot)和熒光斑點(diǎn)檢測(cè)是檢測(cè)未暴露于SARS-CoV-2的個(gè)體中交叉響應(yīng)性記憶CD4+ T細(xì)胞的關(guān)鍵單細(xì)胞技術(shù)，而交叉響應(yīng)性記憶CD8+ T細(xì)胞則不常見(jiàn)。據(jù)推測(cè)，交叉響應(yīng)性記憶CD4+ T細(xì)胞可能通過(guò)促進(jìn)B細(xì)胞和抗體反應(yīng)，或通過(guò)介導(dǎo)感染部位(包括肺部和上呼吸道)的快速局部抗病毒免疫，提供對(duì)SARS-CoV-2感染的保護(hù)性免疫，并降低疾病嚴(yán)重程度。然而，據(jù)報(bào)道，預(yù)先存在的交叉響應(yīng)性記憶CD4+ T細(xì)胞可能不僅具有低TCR，克隆擴(kuò)張降低，而且還會(huì)加劇炎癥和疾病嚴(yán)重程度，特別是在老年人中。因此，先前存在的交叉響應(yīng)性記憶T細(xì)胞在一般人群中SARS-CoV-2感染和疫苗接種中的作用值得進(jìn)一步研究。
5.單細(xì)胞水平的免疫保護(hù)相關(guān)因素
隨著COVID-19免疫學(xué)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集的快速增長(zhǎng)，如何利用當(dāng)前和新興的公共數(shù)據(jù)集是醫(yī)學(xué)家和研究者們面臨的問(wèn)題之一。正在進(jìn)行的COVID-19候選疫苗療效試驗(yàn)生成單細(xì)胞免疫圖譜數(shù)據(jù)集，這些數(shù)據(jù)集可以被用于識(shí)別風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)因素以及保護(hù)相關(guān)因素。由于COVID-19疫苗有效性試驗(yàn)的樣本量有限，且有大量的免疫生物標(biāo)志物可能被評(píng)估為相關(guān)因素，因此開展試點(diǎn)研究以優(yōu)化和識(shí)別具有良好統(tǒng)計(jì)特性的相關(guān)分析方法和相關(guān)免疫特征至關(guān)重要。確定最佳相關(guān)性的重要因素包括:高可重復(fù)性、大規(guī)模的疫苗接種者、低假陽(yáng)性率等。為加快相關(guān)分析，現(xiàn)有的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集可以被用來(lái)優(yōu)化和識(shí)別可重復(fù)性較高的單細(xì)胞免疫信號(hào)。
這些整理數(shù)據(jù)集的另一個(gè)主要應(yīng)用是基于整合分析和meta分析識(shí)別可能參與SARS-CoV-2進(jìn)展的相關(guān)因素等，例如最近對(duì)107個(gè)肺scRNA-seq研究的薈萃分析，發(fā)現(xiàn)可能參與SARS-CoV-2感染的蛋白酶。
圖2展示出一種將公開可用的單細(xì)胞數(shù)據(jù)組織起來(lái)用于綜合分析的方法。收集的21個(gè)數(shù)據(jù)集中個(gè)體的年齡(左)和性別(右)分布如圖2a所示。組織類型的樣本數(shù)量如2b所示?；赨MAP對(duì)來(lái)自于16個(gè)PBMC和全血來(lái)源的超過(guò)250萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞映射到Seurat CITE-seq參考中，并通過(guò)參考定義的細(xì)胞類型對(duì)細(xì)胞進(jìn)行著色和標(biāo)記（圖2c）。并基于Wilcoxon檢驗(yàn)識(shí)別不同狀態(tài)，不同癥狀程度，不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)樣本中CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞等細(xì)胞豐度間的差異（圖2d）。
圖2. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可視化表示
此外，研究者們對(duì)21個(gè)已發(fā)布的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集(超過(guò)320萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行整合概況，提供標(biāo)準(zhǔn)化、質(zhì)量控制后可下載版本的數(shù)據(jù)以及UMAP映射圖展示，并構(gòu)建一個(gè)可用于數(shù)據(jù)探索的交互式可視化網(wǎng)站（https://atlas.fredhutch.org/fredhutch/covid）。
圖3. 可視化網(wǎng)站示例
該網(wǎng)站提供特定數(shù)據(jù)集以及整合數(shù)據(jù)集探索分析。
提供相應(yīng)數(shù)據(jù)集合的數(shù)據(jù)來(lái)源，組織來(lái)源，細(xì)胞類型等信息展示。
對(duì)于選定數(shù)據(jù)集合提供細(xì)胞，蛋白，基因搜索功能。
從而得到相應(yīng)細(xì)胞中發(fā)生差異表達(dá)的基因。
以及相應(yīng)蛋白或者基因的UMAP映射圖。
COVID-19的單細(xì)胞數(shù)據(jù)有了，但是分析思路不清晰怎么辦呢？別著急，下面小編將以兩篇文章為例簡(jiǎn)單介紹下COVID-19單細(xì)胞免疫分析思路。
第一項(xiàng)工作為表征COVID-19患者的免疫學(xué)特征，研究者對(duì)13例新冠患者和5例健康捐獻(xiàn)者（HDs）的PBMCs進(jìn)行scRNA-seq分析，最終得到122,542個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜。并將13例COVID-19患者分為三種臨床情況：中度(n=7)，重度(n=4)和恢復(fù)期（n=6例，其中4例與中度病例配對(duì))，分析不同細(xì)胞條件下細(xì)胞組成，并進(jìn)行差異基因分析以及B細(xì)胞，T細(xì)胞的亞型特點(diǎn)分析。此外，還對(duì)每個(gè)受試者進(jìn)行單細(xì)胞T細(xì)胞受體(TCR)和B細(xì)胞受體(BCR)測(cè)序分析[2]。
COVID-19患者的免疫學(xué)特征分析
第二項(xiàng)工作通過(guò)對(duì)196名COVID-19患者和正常對(duì)照組的284份樣本進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，創(chuàng)建一個(gè)包含146萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的全面免疫圖譜。通過(guò)對(duì)免疫圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以確定外周免疫亞型的變化與不同的臨床特征相關(guān)，包括年齡、性別、嚴(yán)重程度和COVID-19的疾病分期。此外，SARS-CoV-2 RNA存在于多種上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞中，并伴有病毒陽(yáng)性細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)改變。外周血中主要由巨核細(xì)胞和單核細(xì)胞引起的S100A8/A9系統(tǒng)性上調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致重癥患者常見(jiàn)的細(xì)胞因子風(fēng)暴[3]。
大規(guī)模COVID-19的單細(xì)胞免疫圖譜
自21年下半年初始，COVID-19疫情在我國(guó)多點(diǎn)散發(fā)，頗有點(diǎn)“你方唱罷我登場(chǎng)”甚至想要的兇猛反撲的架勢(shì)。冬奧臨近，身為半個(gè)醫(yī)學(xué)生的我們?cè)谛⌒闹?jǐn)慎，做好個(gè)人防護(hù)的同時(shí)，也別忘了對(duì)COVID-19致病機(jī)制和預(yù)防控制方面進(jìn)行深入研究哦。
好啦，各位小伙伴，今天的內(nèi)容就是這些，對(duì)COVID-19單細(xì)胞免疫分析感興趣的朋友一定要認(rèn)真學(xué)習(xí)下今天的這幾篇文章哦，我們下次再見(jiàn)啦。
參考文獻(xiàn)：
1. Single-cell immunology of SARS-CoV-2 infection
2. Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19
3. COVID-19 immune features revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas
