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DNA methylation subtypes guiding prognostic assessment and linking to responses the DNA methyltransferase inhibitor SGI-110 in urothelial carcinoma
鑒定尿路上皮癌中具有預(yù)后分層的DNA甲基化亞型
一．研究背景
尿路上皮癌（UC）是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，包括膀胱癌和上尿路上皮癌，膀胱癌（UCB）占UC的90-95%，而上尿路上皮癌（UTUC）并不常見，占UC的5-10%。雖然基因組研究表明UTUC和UCB之間的體細(xì)胞改變發(fā)生率存在顯著差異，但UTUC和UCB之間的表觀遺傳差異程度和臨床相關(guān)性仍是未知。越來越多的證據(jù)表明DNA甲基化與UCB腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。最初，DNA超甲基化的研究集中于潛在候選基因的CpG島。獨(dú)特的DNA甲基化模式可以區(qū)分非肌層浸潤(rùn)性和肌層浸潤(rùn)性UCB，并與臨床預(yù)后相關(guān)。然而，UTUC中的DNA甲基化分析以及圖譜研究仍然很少見。UTUC和UCB之間差異DNA甲基化的比較分析也比較有限，研究通常集中在選定的癌癥相關(guān)基因上。已有文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)于一些基因，UTUC中的啟動(dòng)子甲基化比UCB中的更常見和廣泛。然而，在之前的研究中，對(duì)腫瘤組織和尿沉渣樣本中UTUC和UCB的全基因組測(cè)序（WGS）和全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）數(shù)據(jù)進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，兩種癌癥類型中都存在類似的基因組CNV和DNA甲基化改變。因此，對(duì)比兩者之間的DNA甲基化譜將有助于UC診斷、預(yù)測(cè)甚至治療的發(fā)展。
二．研究方法
在本研究中，研究者收集了上尿路上皮癌旁組織、上尿路上皮癌和膀胱癌組織共49例。通過整合全基因組甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)研究了UTUC和UCB的表觀基因組特征和圖譜并發(fā)現(xiàn)上尿路上皮癌和膀胱癌的DNA甲基化圖譜非常相似。進(jìn)一步通過對(duì)腫瘤的DNA甲基化模塊進(jìn)行非負(fù)矩陣分解鑒定出兩種與預(yù)后相關(guān)的DNA甲基化亞型（Methy-High和Methy-Low），以探索腫瘤的潛在風(fēng)險(xiǎn)分層。此研究還發(fā)現(xiàn)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑SGI-110通過上調(diào)多種抗腫瘤免疫通路抑制Methy-High 亞型膀胱癌細(xì)胞系的遷移和侵襲。
三．研究結(jié)果
1、UTUC和UCB的DNA甲基化譜比較
為了研究UTUC和UCB之間DNA甲基化圖譜的潛在差異，研究者使用全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）檢測(cè)了原發(fā)性腫瘤組織的全基因組DNA甲基化譜，包括36個(gè)UTUC樣本和9個(gè)UCB樣本，以及4個(gè)相鄰正常組織。正如預(yù)期的那樣，當(dāng)將兩種類型的腫瘤與相鄰的正常組織進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化水平在全基因組水平上降低，在啟動(dòng)子區(qū)域和5′UTR區(qū)域增加（圖1A）。密度圖進(jìn)一步顯示，與正常鄰近組織相比，UC腫瘤組織中的DNA甲基化整體水平降低（圖1B）。引人注目的是，UTUC和UCB中的DNA甲基化情況相似（圖1C、D）。如圖1E所示，對(duì)于一個(gè)具有代表性的基因組位點(diǎn)，chr1:32132880-53207909，UTUC和UCB中都證明了全局去甲基化，并且UTUC和UCB之間的DNA甲基化圖譜非常相似。
2. DNA甲基化亞型分類
接下來，該工作研究了UC中是否存在不同的DNA甲基化亞型。研究者使用甲基化單倍型(methylation haplotype block，MHB）分析方法在UC腫瘤組織和正常鄰近組織中鑒定了84345個(gè)組織特異性甲基化單倍型區(qū)塊（MHB）。采用了非負(fù)矩陣分解算法對(duì)UC樣本進(jìn)行分類，使用具有最多可變甲基化單倍型負(fù)荷（MHL）的前20000個(gè)MHB（圖2A）。45例UC樣本分為兩個(gè)亞型：Methy-C1（n=19；42.2%）和Methy-C2（n=26；57.8%）（圖2B）。
3. UC甲基化亞型的臨床病理相關(guān)性
為了研究UC中DNA甲基化亞型的臨床相關(guān)性，對(duì)44名UC患者、TCGA隊(duì)列中的411名UCB患者和日本隊(duì)列中的86名UTUC患者進(jìn)行了臨床病理學(xué)關(guān)聯(lián)分析。在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中，屬于Methy-High亞型的腫瘤患者的總生存期低于屬于Methy-Low亞型的腫瘤患者。同樣，屬于Methy-High亞型的腫瘤患者的無進(jìn)展生存期也較短（圖2C）。此外，Methy-High亞型富集于更高的腫瘤分期(≥T3、12/25與2/19）和肌肉浸潤(rùn)性腫瘤（19/25與6/19）（圖2D，E）。此外，對(duì)于日本隊(duì)列，同樣確定了兩種甲基化亞型（Methy-Low（n=52）和Methy-High（n=34）），并進(jìn)一步證實(shí)甲基化高亞型具有較短的疾病特異性生存率和無進(jìn)展生存率（圖2F）。由于研究者只確定了有限數(shù)量的UCB患者的WGSB圖譜，因此整合了TCGA（n=411）的人類甲基化450（EPIC）BeadChip陣列數(shù)據(jù)。使用類似的策略，定義了UCB患者的Methy-High和Methy-Low亞型。值得注意的是，與UCB組中的Methy-Low亞型患者相比，Methy-High亞型患者的總生存期更短，腫瘤分期更高（圖2G）。通過單變量Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，T分期、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和甲基化亞型與患者生存率顯著相關(guān)。進(jìn)一步的多變量Cox回歸顯示，甲基化亞型是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素（圖2H）。
4. Methy-High 的UC患者以basal相關(guān)基因表達(dá)為主，免疫和基質(zhì)評(píng)分較高
為了描述定義UC甲基化亞型的基因表達(dá)譜，對(duì)9個(gè)UTUC腫瘤進(jìn)行了RNA-seq測(cè)序，包括4個(gè)Methy-High亞型和5個(gè)Methy-Low亞型，以及已發(fā)表的TCGA UCB隊(duì)列。首先，與Methy-Low亞型相比，在Methy-High亞型中識(shí)別出1664個(gè)上調(diào)基因和575個(gè)下調(diào)基因（圖3A）。并發(fā)現(xiàn)在Methy-High中，免疫反應(yīng)、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和多種信號(hào)通路（缺氧、糖酵解和血管生成）上調(diào)（圖3B，C）。雖然樣本量較小，但Methy-High腫瘤的免疫和基質(zhì)評(píng)分往往高于Methy -Low腫瘤（圖3D，E）。為了更好地了解每個(gè)甲基化亞型的特征，使用TCGA-UCB數(shù)據(jù)集比較了UTUC和UCB的Methy-High和Methy-Low之間的基因表達(dá)，以及涉及獨(dú)特UCB亞型的一組功能途徑。發(fā)現(xiàn)甲基高UC腫瘤的特征是“basal”標(biāo)記物上調(diào)。與Methy-Low亞型相比，Methy-High亞型的basal標(biāo)記物、EMT標(biāo)記物和血管生成標(biāo)記物也上調(diào)（圖3F）。
5. Methy-High UC具有T細(xì)胞炎癥和免疫抑制環(huán)境
研究者使用TIP系統(tǒng)地評(píng)估了每個(gè)甲基化亞型的免疫表型，發(fā)現(xiàn)與Methy-Low亞型UC患者相比，Methy-High亞型UC患者的腫瘤抗原呈遞和免疫細(xì)胞向腫瘤的轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)，而Methy-Low亞型UC患者的T細(xì)胞識(shí)別癌細(xì)胞的能力減弱（圖4A）。在UTUC組和UCB組中，Methy-High患者的免疫細(xì)胞向腫瘤轉(zhuǎn)移的得分顯著較高（圖4B）。然而，在UTUC和UCB組中，Methy-High患者的T細(xì)胞識(shí)別癌細(xì)胞的得分較低（圖4C）。總的來說，這些結(jié)果表明Methy-High患者具有免疫抑制表型的炎癥腫瘤。為了更好地評(píng)估免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在調(diào)節(jié)每個(gè)甲基化亞型的免疫表型中的作用，進(jìn)一步通過MCPcounter估算了腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的豐度。并發(fā)現(xiàn)Methy-High亞型腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞的數(shù)量顯著高于Methy-Low（圖4D，E）。成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在Methy-High組均顯著高于Methy-Low UCB患者，在UTUC患者中也觀察到類似的趨勢(shì)（圖4D，E）。進(jìn)一步證實(shí)，Methy-High患者浸潤(rùn)性成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的比例高于Methy-Low患者（圖4F）。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，免疫細(xì)胞和基質(zhì)成分在形成Methy-High UC患者的免疫抑制表型時(shí)具有高度參與性。與這些免疫反應(yīng)特征和基質(zhì)反應(yīng)一致，在Methy-High亞型中，與抗原呈遞機(jī)制和細(xì)胞溶解活性以及免疫逃避標(biāo)記物PD1、PD-L1、PD-L2和CTLA4相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增加（圖4G）。此外，Methy-High亞型顯示泛成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子b（TGFβ）反應(yīng)信號(hào)（F-TBRS）基因的表達(dá)增強(qiáng)（圖4G），這是成纖維細(xì)胞中TGFβ途徑活性的指標(biāo)，并與免疫治療的耐藥性有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明，激活的基質(zhì)信號(hào)可能在Methy-High腫瘤的免疫抑制表型中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步證實(shí)，Methy-High患者的免疫抑制評(píng)分高于Methy-Low患者（圖4H）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，免疫治療和抗TGFβ治療的結(jié)合可能會(huì)改善Methy-High患者的臨床結(jié)果。
6. 用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（SGI-110）處理T24和UMUC-3細(xì)胞顯示出治療效果
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（DNMTis）已成為逆轉(zhuǎn)DNA高甲基化和相關(guān)基因沉默的新治療工具。研究者使用SGI-110處理T24和UMUC-3細(xì)胞，在無藥物培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，分別通過傷口愈合和transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞遷移和侵襲能力。發(fā)現(xiàn)SGI-110處理顯著抑制兩種細(xì)胞系中的細(xì)胞遷移（圖5A，B）和侵襲能力（圖5C，D）。UMUC-3細(xì)胞比T24細(xì)胞對(duì)SGI-110處理更敏感（圖5）。總的來說，觀察到在停止SGI-110治療后細(xì)胞遷移和侵襲受到抑制，這可能解釋了SGI-110治療后觀察到的抗腫瘤作用。
7. 整合分析確定T24和UMUC-3細(xì)胞中的SGI-110靶基因
為了確定SGI-110的潛在治療價(jià)值，研究者評(píng)估了用SGI-110治療T24和UMUC-3細(xì)胞后的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)SGI-110治療后上調(diào)的基因在多種抗腫瘤免疫途徑中顯著富集，如干擾素信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞因子/趨化因子、抗原處理和癌-睪丸抗原（圖6A）。SGI110治療上調(diào)的許多基因是抗腫瘤干擾素反應(yīng)信號(hào)的一部分或下游，包括與抗原呈遞和細(xì)胞因子/趨化因子相關(guān)的基因（圖6B，C），還發(fā)現(xiàn)SGI110處理后，兩種細(xì)胞系中參與抗病毒活性的多個(gè)基因均上調(diào)（圖6D，E）。這種反應(yīng)被稱為“病毒模擬”，因?yàn)榧?xì)胞對(duì)外源性病毒感染的反應(yīng)是一樣的。在SGI-110處理后，從轉(zhuǎn)座因子（包括SINE、LINEs和LTR）中識(shí)別出大量reads（圖6F，G）。這些發(fā)現(xiàn)與早期文獻(xiàn)報(bào)道一致，如LINE和SINE可能觸發(fā)AZA治療應(yīng)答者的先天免疫系統(tǒng)激活。最后，還檢測(cè)了癌-睪丸抗原的基因表達(dá)水平，這也被認(rèn)為在激活免疫系統(tǒng)和殺死癌細(xì)胞方面發(fā)揮重要作用。事實(shí)上，研究者觀察到T24和UMUC-3細(xì)胞中共享和細(xì)胞類型特異性癌-睪丸抗原上調(diào)（圖6H）?？傊琒GI-110上調(diào)了多種抗腫瘤免疫途徑。
四、總結(jié)
綜上所述，該工作顯示UTUC和UCB中類似的潛在DNA甲基化圖譜。為臨床實(shí)踐提供了路線圖：DNA甲基化亞型分類可用于預(yù)測(cè)切除的UC患者的預(yù)后，并幫助確定哪些患者可能受益于基于順鉑的化療或使順鉑耐藥的癌細(xì)胞重新敏感。此外，也為SGI-110與免疫檢查點(diǎn)療法聯(lián)合治療UC提供了理論依據(jù)。文章一開始從DNA甲基化分子分型出發(fā)，逐步闡述各個(gè)不同亞型之間的特征，并且進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在每一個(gè)層面都進(jìn)行了詳盡分析，文章故事邏輯清晰合理，并且該研究有收集新的樣本隊(duì)列，所以可以到10+。
