肝細(xì)胞癌凝血相關(guān)基因的免疫浸潤(rùn)及臨床意義分析

今天小編給大家?guī)硪黄衲昶咴翨riefings in Bioinformatics雜志新鮮出爐的文章：Immune infiltration and clinical significance analyses of the coagulation-related genes in hepatocellular carcinoma（IF=13.994）。本篇文章基于KEGG數(shù)據(jù)庫中收集的凝血途徑，在肝細(xì)胞癌患者中區(qū)分了兩種與凝血相關(guān)的亞型。并證明了兩種凝血相關(guān)亞型在免疫特征和預(yù)后分層方面的明顯差異。在TCGA隊(duì)列中建立了凝血相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)后模型，用于風(fēng)險(xiǎn)分層和預(yù)后預(yù)測(cè)。還建立了一個(gè)nomogram，以便于臨床使用該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并使用不同的方法驗(yàn)證其有效性。

背景

原發(fā)性肝癌(PLC)是第六大常見惡性腫瘤，其中肝細(xì)胞癌是最常見的類型之一。全世界每年確診的肝癌病例超過70萬例，其中一半來自中國(guó)。惡性腫瘤患者易發(fā)生一些并發(fā)癥，如靜脈血栓(VTE)，門靜脈血栓(PVT)都是肝細(xì)胞癌患者中最常見的并發(fā)癥。凝血可以導(dǎo)致出血和血管壁破裂，也可以通過增加血管通透性和血漿外滲，從而導(dǎo)致血管外凝血。許多肝病，如肝硬變、自身免疫性肝病和肝腫瘤，都存在凝血系統(tǒng)紊亂。而最近的相關(guān)報(bào)道顯示，凝血與腫瘤免疫微環(huán)境有關(guān)。

TME在肝細(xì)胞癌的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。腫瘤凝固體，一個(gè)由癌癥驅(qū)動(dòng)的有利于血栓形成或出血的分子效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，已經(jīng)成為癌癥研究的熱點(diǎn)。凝固體可以與TME相互作用，甚至影響腫瘤免疫反應(yīng)。凝血系統(tǒng)的激活有助于啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，募集和激活多形核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。為了提高抗腫瘤免疫，抗凝劑可能是免疫檢查點(diǎn)阻滯劑(ICB)的有效輔助治療。直接口服抗凝劑(DOAC)利伐沙班可增強(qiáng)ICB對(duì)惡性黑色素瘤的療效。

結(jié)果解讀

CRG體細(xì)胞變化景觀

作者首先對(duì)TCGA數(shù)據(jù)中355例肝細(xì)胞癌患者的SCNA和突變頻率進(jìn)行可視化，約65.9%的患者發(fā)生CRG的DNA突變，CRG的DNA突變水平從2%到5%（圖1A,B）。雖然CRG中沒有觀察到很高的突變頻率，但SCNA是大多數(shù)DNA改變的原因。約66.57%的肝細(xì)胞癌患者至少有一個(gè)CRG的SCNA。大多數(shù)具有高CNA頻率的CRG傾向于共擴(kuò)增而不是共缺失（圖1G）。此外，Kaplan-Meier生存曲線顯示，CNA頻率低的患者比CNA頻率高的患者有更長(zhǎng)的OS和PFS。

肝細(xì)胞癌凝血亞型的鑒定

根據(jù)TCGA中CRGs的表達(dá)水平，采用非監(jiān)督聚類，確定了兩種不同的調(diào)控模式，包括凝血相關(guān)簇1中的200例患者和凝血相關(guān)簇2中的109例患者。對(duì)三個(gè)數(shù)據(jù)集(TCGA、ICGC和GSE14103)進(jìn)行評(píng)估，簇1的生存優(yōu)勢(shì)都高于簇2（圖2C）。簇1患者的組織學(xué)G1、Child1級(jí)、TNM分期I-II和存活結(jié)果的比例高于簇2，卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示不同臨床特征之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2E）。也就是說CRGs可能通過一些潛在的機(jī)制影響腫瘤的發(fā)展。

凝血亞型的免疫格局

GSVA發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)亞型有著不同的免疫滲透模式。簇1顯著富含免疫和炎癥通路(包括T細(xì)胞受體信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、nod-like受體信號(hào)通路、toll-like受體信號(hào)通路)和肝癌干細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)通路(notch信號(hào)通路和wnt信號(hào)通路)（圖3A）。GSEA分析證實(shí)兩個(gè)簇在免疫途徑上存在差異。簇1中高表達(dá)的DEGs顯著富集在T細(xì)胞受體信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、Th1和Th2細(xì)胞分化以及Th17細(xì)胞分化。使用ImmuneCellAI，研究了兩個(gè)集群的TME。簇1中高表達(dá)CD8、CD8、CD4、CD8、CD8、NKT、Th1等細(xì)胞，而簇2中高表達(dá)樹突狀細(xì)胞、誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Th17、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞?；赥CGA表達(dá)譜的估計(jì)算法計(jì)算惡性腫瘤組織的間質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分和ESTIMATE評(píng)分。

簇1樣本的評(píng)估分?jǐn)?shù)也顯著高于簇2，基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分也顯著高于簇2。包括TMB評(píng)分、TEDGE評(píng)分和免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)在內(nèi)的一系列評(píng)價(jià)指標(biāo)代表了對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的反應(yīng)。經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn)，PD-1、PD-L1、CTLA4、HAVCR2、LAG3和TIGIT的表達(dá)水平簇1均顯著高于簇2，TMB評(píng)分也明顯高于簇2（圖4）。

關(guān)鍵CRG的識(shí)別

圖5A圖由200個(gè)節(jié)點(diǎn)和6742條邊組成的CRG的PPI網(wǎng)絡(luò)。采用度和最大鄰域分量(MNC)兩種拓?fù)渌惴◤膹?fù)雜的PPI網(wǎng)絡(luò)中識(shí)別HUB基因。由兩種方法計(jì)算的前20個(gè)基因如圖5B所示。在這兩種算法中，這些基因的排序序列是相同的。因此，這20個(gè)CRG可以被視為凝血途徑的樞紐基因。借助GSE19151，包括深靜脈血栓形成樣本和正常樣本，進(jìn)一步篩選出關(guān)鍵的CRG。LIMMA識(shí)別了VTE和正常樣本之間的總共740個(gè)度。來自GSE19151和前20個(gè)CRG的重疊DEG發(fā)現(xiàn)了三個(gè)關(guān)鍵的CRG(PRKACA、PIK3R1和ITGB2)（圖5D）。PRKACA和ITGB2在大多數(shù)癌癥的腫瘤樣本中上調(diào)，PIK3R1主要在LIHC、THCA和KIRP中上調(diào)。三個(gè)關(guān)鍵CRG在KIRC、KIRP、LIHC和THCA中均表現(xiàn)出擴(kuò)增的表達(dá)模式。泛癌生存分析表明，關(guān)鍵的CRG在多種癌癥中起到保護(hù)作用（圖5F）。

對(duì)TCGA數(shù)據(jù)集進(jìn)行單變量COX回歸。發(fā)現(xiàn)只有PIK3R1可作為肝癌的良好保護(hù)因子。PIK3R1與肝細(xì)胞癌中的OS顯著相關(guān)。最后進(jìn)行多變量Cox回歸，變量包括PIK3R1、T期、N期和M期。發(fā)現(xiàn)PIK3R1可作為獨(dú)立的預(yù)后因素（圖6D）。結(jié)果再次表明，凝血途徑與肝癌患者的生存密切相關(guān)，即PIK3R1可能是一個(gè)對(duì)惡性腫瘤患者具有更好預(yù)測(cè)價(jià)值的保護(hù)因子。

凝血相關(guān)signature在預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后中的作用

使用TCGA數(shù)據(jù)中有OS信息肝細(xì)胞癌患者建立預(yù)后模型。采用LASSO Cox回歸分析從300個(gè)CRG中篩選出最佳預(yù)后信號(hào)。將變量引入Lasso Cox回歸模型，選取11個(gè)凝血相關(guān)指標(biāo)，建立凝血相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(CRRS)模型。其中一些標(biāo)志物如PLCB4、GP6、PIK3R1、GP1BA和PLA2G4F的表達(dá)水平似乎無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但可能與其他標(biāo)志物和預(yù)后相關(guān)。SERPINA1、PLCB3、PIK3R6和PPP1CB的表達(dá)水平與預(yù)后顯著正相關(guān)，而GP6、P2RX1、PLA2G4F、PLCB4、GP1BA、PIK3R1和CFHR3的表達(dá)水平則相反（圖7 C,D）。與其他單因素COX回歸模型相比，組合模型具有最高的C指數(shù)。在三個(gè)不同的數(shù)據(jù)集(TCGA、ICGC和GSE14520)中，與其他單一信號(hào)相比，聯(lián)合模型的ROC曲線下面積(AUC)最大，這證明聯(lián)合模型的預(yù)測(cè)效率最高（圖7G）。對(duì)于生存分析，根據(jù)建立的計(jì)算公式計(jì)算每個(gè)患者的CRRS，包括微陣列數(shù)據(jù)(GSE14520、GSE76427和GSE10143)和測(cè)序數(shù)據(jù)(TCGA和ICGC)。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，這些病例被分為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)隊(duì)列。

基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的肝癌治療策略

比較5種免疫檢查點(diǎn)分子(PD1、PD-L1、CTLA4、LAG3和HAVCR2)在高低危險(xiǎn)組的表達(dá)。三種免疫檢查點(diǎn)分子(PD-L1、CTLA4和LAG3)在高危人群中顯著上調(diào)（圖8A）。IPS、IPS-CTLA4、IPS-PD1和IPS-PD1-CTLA4評(píng)分在高危人群中較高（圖8B）。作者比較了TMB、TME評(píng)分和TEDER評(píng)分在不同風(fēng)險(xiǎn)組中的分布。發(fā)現(xiàn)高危人群的TMB和TME評(píng)分較高，TIDE評(píng)分則相反（圖8C,D,E）。目前，免疫治療發(fā)展的瓶頸之一是缺乏新的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。根據(jù)上述研究，凝血亞型與免疫微環(huán)境有顯著相關(guān)性，因此我們?cè)噲D研究CRRS能否預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌的免疫治療反應(yīng)。

使用接受抗PD-L1治療的尿路上皮癌數(shù)據(jù)集(IMvigor210)和接受抗PD-1和抗CTLA4治療的惡性黑色素瘤數(shù)據(jù)集(GSE91016)作為測(cè)試集。根據(jù)IMvigor210、GSE91016和GSE140901的結(jié)果，不同凝血亞型之間的反應(yīng)亞型(CR、PR、SD和PD)有顯著差異。CRRS值高的患者SD/PD比例較高，CRR值低的患者CR/PR比例較高。將三個(gè)數(shù)據(jù)中接受免疫治療的患者分為高CRRS亞型和低CRRS亞型。使用ROC分析來評(píng)估CRRS免疫治療益處的預(yù)測(cè)潛力。ROC曲線下的面積(AUC)在IMvigor210中為0.9013，在GSE140901中為0.9444，在GSE91061中為0.9016。這些結(jié)果表明，低風(fēng)險(xiǎn)組比高風(fēng)險(xiǎn)組對(duì)免疫治療的反應(yīng)更好。這就解釋了為什么低CRRS的肝細(xì)胞癌患者的存活率高于高CRRS的患者。

在GSE104580中檢驗(yàn)CRRS在接受TACE治療的肝癌患者中的預(yù)測(cè)價(jià)值。該數(shù)據(jù)包括TACE反應(yīng)和TACE耐藥的肝細(xì)胞癌患者的mRNA表達(dá)陣列。通過比較GSE104580的CRRS，發(fā)現(xiàn)TACE有效組的CRRS高于TACE耐藥組（圖9A）。ROC曲線顯示CRRS對(duì)TACE耐藥有較高的診斷價(jià)值。此外，在GSE69164和GSE7750中闡明了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和PVTT之間的關(guān)系（圖9 B,C）。有門靜脈血栓形成的肝癌患者的CRRS明顯高于無門靜脈血栓形成的肝癌患者，ROC曲線也證明CRRS能特異性地區(qū)分有無門靜脈血栓形成的肝癌患者。計(jì)算每例肝癌患者對(duì)6種常用化療藥物的IC50值。通過比較兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組IC50值的差異，我們發(fā)現(xiàn)高CRRS亞組對(duì)除羅可維汀外的大多數(shù)藥物敏感（圖9D）。利用藥物基因相互作用數(shù)據(jù)庫(DGIdb)尋找對(duì)肝癌有治療作用的小分子藥物。在PubChem中發(fā)現(xiàn)了阿司匹林、Alpelisib、Copanlisib、Sonolisib、PF-04691502和Pilaralisib的三維結(jié)構(gòu)斷層掃描（圖9E）。

CRRS可作為肝細(xì)胞癌的獨(dú)立預(yù)后因素

通過單因素和多因素的COX回歸分析來確定CRRS是否是肝細(xì)胞癌患者臨床獨(dú)立的預(yù)后因素。將CRRS、年齡、性別、兒童分級(jí)、腫瘤類型和TNM分期作為協(xié)變量進(jìn)行分析（圖10 A,B）。結(jié)果表明，年齡、分期和CRRS是可用于預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。通過結(jié)合獨(dú)立的預(yù)后因素，作者構(gòu)建了一個(gè)nomogram，作為臨床相關(guān)的量化方法，臨床醫(yī)生可以通過它來預(yù)測(cè)肝癌患者的死亡率（圖10C）。通過將每個(gè)預(yù)后參數(shù)的打分相加，每個(gè)患者將被分配一個(gè)總打分值?？偡衷礁?，患者越差。此外，多個(gè)隊(duì)列(TCGA、ICGC和GSE76427)的校準(zhǔn)圖表明，nomogram的性能與理想模型的性能相似?；赥CGA數(shù)據(jù)的不同變量的隨時(shí)間變化的C指數(shù)曲線顯示，與其他單一因素相比，nomogram的表現(xiàn)最佳。三個(gè)數(shù)據(jù)隨時(shí)間變化的ROC也表明，nomogram具有很高的預(yù)測(cè)能力（圖10 D,E,F）。

總結(jié)

在這篇文章的研究中，利用無監(jiān)督聚類算法，基于TCGA數(shù)據(jù)識(shí)別與凝血相關(guān)的分子亞型。比較了兩種凝血亞型在富集注釋、TME和免疫治療反應(yīng)方面的差異。然后，作者探索了凝血途徑中的關(guān)鍵基因，并驗(yàn)證了它們對(duì)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的重要價(jià)值?；贚ASSO Cox回歸模型篩選出的7個(gè)預(yù)后指標(biāo)，從TCGA隊(duì)列中構(gòu)建了肝癌患者凝血相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(CRRS)預(yù)后模型。在不同的平臺(tái)數(shù)據(jù)集上評(píng)價(jià)其對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE)和化療的生存概率和治療效果的預(yù)測(cè)能力。最后，結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和其他預(yù)后臨床指標(biāo)，構(gòu)建一個(gè)nomogram來量化生存概率。根據(jù)這些結(jié)果，可以得出結(jié)論，肝癌患者的凝血狀態(tài)與TME之間存在明顯的相關(guān)性，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可以作為一個(gè)強(qiáng)有力的預(yù)后生物標(biāo)志物，為化療和免疫治療提供治療益處，并可能有助于肝癌患者的臨床決策。