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大家好！今天為大家介紹的是英國牛津大學Irina A. Udalova研究團隊于2021年9月發(fā)表的關于中性粒細胞發(fā)育調(diào)控的一篇干濕結合文章（IF：25.606）。免疫細胞發(fā)育調(diào)控機制一直是基礎免疫學研究的重要方向，本研究以新思路解析經(jīng)典問題，涉及大量的數(shù)據(jù)分析和實驗，多處細節(jié)值得我們細細推敲，好啦，下面我們就開始學習這篇文章吧！
不同轉錄因子網(wǎng)絡控制中性粒細胞的炎癥驅動
中性粒細胞根據(jù)其發(fā)育階段、激活狀態(tài)和組織微環(huán)境的不同表現(xiàn)出多種基因表達模式。為明確中性粒細胞調(diào)控基因表達的轉錄因子網(wǎng)絡，研究人員對急性炎癥過程中中性粒細胞的轉錄組和染色質分析進行整合。結果顯示，骨髓到血液和血液到組織兩個過渡階段中性粒細胞染色質重塑活躍。通過體內(nèi)外實驗聯(lián)合驗證，證實RUNX1和KLF6調(diào)節(jié)中性粒細胞的成熟，而RELB、IRF5和JUNB驅動中性粒細胞炎性應答，RFX2和RELB促進生存。此外，JUNB表達抑制中性粒細胞的激活，可降低心肌梗死小鼠模型的病理性炎癥損傷程度。明確急性炎癥過程中中性粒細胞的轉錄調(diào)控機制，可為細胞功能的階段性治療提供新靶點。
背景：
中性粒細胞在分化成熟過程中表現(xiàn)出明顯的形態(tài)變化以及表面受體的階段性表達模式。細胞進入血液循環(huán)后，以多樣化形式參與調(diào)控炎性應答。目前多項證據(jù)顯示：中性粒細胞是轉錄活躍細胞，可通過改變其自身的轉錄活性調(diào)控細胞分化和組織遷移，在多種免疫性疾病和癌癥中表現(xiàn)出表型和功能的異質性，但內(nèi)在調(diào)控機制仍不明確。
方法：bulk mRNA-seq+ATAC-seq+細胞實驗+小鼠實驗
結果：
1，炎性中性粒細胞處于動態(tài)轉錄控制之下
在小鼠的背部注射空氣形成囊腔，肉芽組織（腔內(nèi)膜）形成后，在腔內(nèi)注射Zymosan（酵母聚糖）刺激中性粒細胞招募和活化，然后對小鼠外周血、腔內(nèi)膜和腔內(nèi)滲出物中的中性粒細胞進行表型評估，發(fā)現(xiàn)白細胞的數(shù)量逐漸升高，IL-1β在腔內(nèi)膜和腔內(nèi)滲出物中逐漸升高。表明中性粒細胞在向組織轉移過程中發(fā)生了活化（圖1a）。
從小鼠骨髓、血液、腔內(nèi)膜和腔內(nèi)滲出物中分離Ly6GhiCD11b+中性粒細胞，進行mRNA-seq和ATAC-seq檢測，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)在中性粒細胞成熟和炎癥級聯(lián)過程中，趨化因子、細胞因子活性和炎性信號路徑基因逐漸上調(diào)，而呼吸鏈復合體、線粒體基質和脂肪酸代謝相關基因則逐漸下調(diào)。轉錄因子的全面分析顯示，中性粒細胞離開骨髓后，其合成能力喪失，在外周循環(huán)中進行信號轉遞，最后在炎癥部位獲得炎性應答表型（圖1b-e）。
2，染色質重塑是轉錄激活的基礎
ATAC-seq數(shù)據(jù)分析顯示，骨髓、血液和腔內(nèi)膜中中性粒細胞的染色質譜存在明顯的多樣性，說明染色質重塑可能是炎癥級聯(lián)反應過程中轉錄變化的基礎。但在炎癥組織到滲出物的過渡期，未觀察到進一步的染色質重塑事件，表明在中性粒細胞遷移過程中基因表達不需要轉錄水平的調(diào)控（圖2a）。此外，ATAC-seq數(shù)據(jù)確定了在骨髓到血液和血液到組織這兩個過渡點上，增加和減少的差異可及性峰值（differentially accessible Peaks, DAPs）數(shù)量相當，說明中性粒細胞染色質重編程存在嚴格的調(diào)控機制（圖2b-c）。結合中性粒細胞亞群scRNA-seq數(shù)據(jù)庫結論[1]，提示中性粒細胞的活化是一個漸進過程，RFX2、KLF6和RUNX1與早期骨髓中性粒細胞向血液的轉移以及持續(xù)促進成熟有關，而信號依賴性轉錄因子JUNB、RELB和IRF5則被認為在炎癥組織中發(fā)揮作用（圖2d-f）。
3，骨髓-血液轉換過程中的轉錄因子控制中性粒細胞成熟
為進一步驗證轉錄因子在中性粒細胞中的功能，利用骨髓祖細胞HoxB8模型系統(tǒng)，經(jīng)CRISPR-Cas9技術選擇性敲除轉錄因子RFX2、KLF6、RUNX1、JUNB、RELB和IRF5，通過中性粒細胞成熟過程中的標志性變化驗證其成熟的程度（圖3a-c），檢測維持中性粒細胞生存相關的轉錄因子以及代謝情況（圖3d-e），并在Lyz2Cre/Cre×Runx1loxP/loxP小鼠模型進行驗證，發(fā)現(xiàn)在進入組織過程中與中性粒細胞染色質關閉相關的兩個基因KLF6和RUNX1，獨立參與中性粒細胞的成熟（圖3f-g）。而RFX2和RELB與染色質開放有關，維持中性粒細胞生存。
4，RUNX1和KLF6的缺失損害中性粒細胞的招募
未成熟中性粒細胞顯示出遷移受損的特性，為明確RUNX1和KLF6對中性粒細胞遷移功能的調(diào)控作用，首先采用Boyden室遷移試驗證實Runx1-/-和KLF6-/-中性粒細胞的遷移明顯減少（圖4a）。為評估RUNX1和KLF6對中性粒細胞成熟和遷移的轉錄程序影響，對Runx1-/-和KLF6-/-和Hoxb8中性粒細胞進行多時間點mRNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)RUNX1和KLF6控制大量白細胞遷移相關基因。為探究RUNX1和KLF6在體內(nèi)中性粒細胞招募中的作用，將CellTracker Far Red標記法跟蹤Runx1-/-，KLF6-/-和Rfx2-/- HoxB8中性粒細胞的轉移情況，發(fā)現(xiàn)RELB和RFX2的缺乏導致中性粒細胞在炎癥部位浸潤減少且生存受限（圖4b-c）。同時，RUNX1缺陷小鼠炎癥部位的成熟中性粒細胞數(shù)量明顯低與野生鼠（圖4d）。由此認為，KLF6和RUNX1處于中性粒細胞分化級聯(lián)的開端，可獨立控制多個關鍵程序，包括中性粒細胞的分化、遷移、顆粒形成和代謝。
5，RELB、IRF5和JUNB控制中性粒細胞的活化和效應功能
為明確染色質開放有關的轉錄因子是否調(diào)節(jié)中性粒細胞活化，研究者對RELB, IRF5, JUNB敲除的HoxB8中性粒細胞進行mRNA-seq檢測分析，然后通過ATAC-Seq分析，在開放染色質區(qū)域搜索共同轉錄因子結合位點相近的基因與mRNA-seq分析的DEGs比較，發(fā)現(xiàn)血液到組織過渡階段激活的轉錄因子中，JUNB對中性粒細胞效應功能的影響最明顯，而IRF5和RELB的作用稍弱（圖5a-c）。IRF5和JUNB缺陷影響中性粒細胞的吞噬能力（圖5d）。而RELB和JUNB對產(chǎn)生ROS（圖5e）、殺滅細菌（圖5f）以及胞外凹陷（NET）的形成（圖5g）非常關鍵。
6，RELB、IRF5和JUNB控制炎癥介質的表達
HoxB8中性粒細胞和小鼠中性粒細胞的RELB、IRF5和JUNB缺陷直接影響影響細胞因子和趨化因子的表達。即IRF5、RELB和JUNB在體外和體內(nèi)炎癥部位能有效調(diào)節(jié)炎癥細胞因子的產(chǎn)生（圖6a-f）。
為證明干擾中性粒細胞激活可抑制體內(nèi)的病理性炎癥，采用中性粒細胞依賴性的左前降支冠狀動脈缺血再灌注誘發(fā)的急性心肌梗死（AMI）小鼠模型進行驗證，發(fā)現(xiàn)敲除中性粒細胞JUNB基因的小鼠心肌梗死面積明顯減少（圖7a-d），而中性粒細胞轉移到炎癥部位不受JUNB缺陷影響（圖4c），但IL-1β和細胞內(nèi)ROS（圖7e-g）的水平均下降。說明中性粒細胞特異性抑制JUNB可減緩中性粒細胞驅動的炎癥期間組織病理性破壞。
小結：
本研究通過系統(tǒng)描述中性粒細胞在不同的發(fā)育階段、激活狀態(tài)下顯示出不同的基因表達譜和轉錄調(diào)控模式，并闡明炎性應答功能的分子調(diào)節(jié)機制。調(diào)控中性粒細胞的轉錄因子激活狀態(tài)有可能成為階段性控制疾病進展的潛在治療策略。
參考文獻：
[1] Xie, X.,Q. Shi. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection[J], 2020, 21(9): 1119-1133.
