掃碼聯(lián)系客服
今天給大家分享一篇發(fā)表在Frontiers in Cell and Developmental Biology（IF:6.081）上的文章:
Metabolism-Associated DNA Methylation Signature Stratifies Lower-Grade Glioma Patients and Predicts Response to Immunotherapy
代謝相關(guān)DNA甲基化特征預(yù)測低級別膠質(zhì)瘤患者亞型以及免疫治療反應(yīng)
一．研究背景
低級別膠質(zhì)瘤（LGG）是常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，具有高復(fù)發(fā)率、高死亡率和高異質(zhì)性。由于腫瘤的高異質(zhì)性，不同的個體通常具有高度可變的預(yù)后和對各種類型治療的不同反應(yīng)。盡管世界衛(wèi)生組織（WHO）的分類納入了分子標(biāo)記，如異檸檬酸脫氫酶（IDH）突變、染色體1p/19q聯(lián)合性缺失和TERT啟動子突變，這大大改善了膠質(zhì)瘤患者的分層，但膠質(zhì)瘤的異質(zhì)性仍需進(jìn)一步闡明。代謝重編程是癌癥的標(biāo)志。它以多種方式影響癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，例如滿足癌細(xì)胞的能量需求，并通過改變底物水平影響各種生物過程。表觀遺傳修飾是在不改變DNA序列的情況下調(diào)節(jié)基因表達(dá)的過程。它是可塑的、可遺傳的，在細(xì)胞分化和細(xì)胞功能中起著關(guān)鍵作用。最近的研究表明DNA甲基化（DNAm）作為表觀遺傳修飾的一種重要形式，已被證明參與致癌過程。DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5號碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團(tuán)，而去甲基化過程則由TET酶介導(dǎo)。除了DNMT和TET酶外，甲基化也可以由代謝調(diào)節(jié)，它們密切相關(guān)。最近的進(jìn)展揭示了癌細(xì)胞中代謝和DNAm之間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系。一方面，代謝變化可以通過改變底物水平影響DNAm。例如，在IDH突變腫瘤中，三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生的異常代謝物2-羥基戊二酸（2-HG）可以抑制TET介導(dǎo)的DNA去甲基化，從而導(dǎo)致基因組甲基化。S-腺苷甲硫氨酸（SAM），在單碳代謝過程中產(chǎn)生，如蛋氨酸循環(huán)和葉酸循環(huán)是調(diào)控DNA甲基化的主要方式，低葉酸飲食據(jù)報道會導(dǎo)致DNA低甲基化并增加腫瘤形成的風(fēng)險。另一方面，DNAm通過影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來調(diào)節(jié)代謝相關(guān)基因的表達(dá)。以上關(guān)于代謝和DNA甲基化的研究主要集中在DNA甲基化上特定代謝物的調(diào)節(jié)機(jī)制研究，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)去探索腫瘤的代謝異質(zhì)性。目前，還沒有文章表述過代謝與DNA甲基化相互作用在癌癥患者分層中的作用。
二．研究方法
在本研究中，旨在研究代謝相關(guān)DNAm在LGG分層中的價值。研究者對來自TCGA、GEO和CGGA數(shù)據(jù)庫以及獨(dú)立隊(duì)列（Qilu cohort）的甲基化數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了綜合分析。評價DNAm與代謝的相關(guān)性。確定了三個具有不同代謝相關(guān)DNAm模式的LGG亞型。此外，研究者還構(gòu)建了一個與亞型相關(guān)的、可量化的CpG信號，以對患者預(yù)后進(jìn)行分層，并預(yù)測對免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）治療的潛在反應(yīng)，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供了一種新的生物標(biāo)志物。
三．研究結(jié)果
1、LGG中代謝相關(guān)DNAm模式的鑒定
作者構(gòu)建流程圖來演示工作流程（圖1A），他們共獲得了708個代謝通路-CpGs對，包括35條代謝通路和391個CpGs?；?91個CPGs，對TCGA隊(duì)列進(jìn)行了k均值聚類。根據(jù)CDF，選擇k=3作為最佳聚類數(shù)（圖1B）。如熱圖所示（圖1C、D），501例LGG患者被分為三個不同的亞組。然后應(yīng)用Kaplan-Meier分析來研究哥亞組的預(yù)后意義。結(jié)果顯示，三個亞組之間的OS存在顯著差異（圖1E）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種甲基化模式的預(yù)后意義，隨后對GEO隊(duì)列（GSE48461和GSE104293）進(jìn)行分型以及Kaplan-Meier分析也顯示了各個亞組之間無進(jìn)展生存率（PFS）的顯著差異（圖1F）。此外，進(jìn)行PCA分析以進(jìn)一步驗(yàn)證TCGA和GEO隊(duì)列的亞型分組（圖1G）。
2. 不同的LGG亞型呈現(xiàn)不同的生物學(xué)特征
隨后，研究者探索了每個亞型的代謝特征。首先，從先前發(fā)表的研究中獲得了114個代謝特征。使用GSVA算法來量化114個代謝特征。然后，進(jìn)行差異分析以確定亞組特異性代謝特征。最終，確定了31個亞組特異性代謝特征（圖2A）。亞組1、亞組2和亞組3分別具有13、3和31個亞組特異性代謝特征。亞組1在谷氨酰胺和谷氨酸代謝以及脂質(zhì)代謝特征得分較高。值得注意的是，第3亞組的31個亞組特異性標(biāo)記中有8個與聚糖代謝相關(guān)，如糖胺聚糖降解?；谶@一結(jié)果，進(jìn)一步研究了亞組3是否具有更活躍的糖基化過程，這一過程已被證明在各種類型的腫瘤疾病中促進(jìn)惡性。正如預(yù)期的那樣，發(fā)現(xiàn)第3亞組糖基化過程的GSVA得分顯著高于其他亞組（圖2B）。為了進(jìn)一步闡明每個亞組的潛在生物學(xué)特征，在亞組之間進(jìn)行了GSEA。結(jié)果表明，預(yù)后最差的第3亞組顯著豐富了細(xì)胞周期和免疫相關(guān)過程（圖2C）。與亞組1相比，亞組2預(yù)后處于中等狀態(tài)，主要集中在胚胎發(fā)育相關(guān)過程中（圖2D）。
3. LGG亞群與臨床和分子特征的相關(guān)性
研究者還研究了三個亞組與LGGs常見臨床特征/分子亞類之間的關(guān)系，包括組織學(xué)分級、IDH突變、MGMT啟動子甲基化、TERT啟動子突變等（圖2H）。在TCGA隊(duì)列中，發(fā)現(xiàn)第1亞組僅由IDH突變體LGG組成，與1p/19q聯(lián)合缺失、PN轉(zhuǎn)錄表型、TERT啟動子突變等密切相關(guān)。在TCGA群組的IDH突變型LGG中，第2亞組與染色體1p/19q非聯(lián)合缺失和G-CIMP-high亞型顯著相關(guān)。亞組3與組織學(xué)III級、甲基化MGMT啟動子、染色體1p/19q非聯(lián)合缺失和G-CIMP-low表型密切相關(guān)。在TCGA隊(duì)列的IDH野生型LGG中，第2亞組與組織學(xué)II級、PA-like亞型和NE轉(zhuǎn)錄亞型相關(guān)，而第3亞組與7號染色體的擴(kuò)增/ 10號染色體缺失、TERT啟動子突變、EGFR擴(kuò)增，以及classic-like和mesenchymal-like亞型。為了探討不同的亞組是否伴有不同的免疫浸潤水平，量化了每個亞組的免疫浸潤豐度。因此，各亞組之間的免疫評分、基質(zhì)評分和綜合評分存在顯著差異，第3亞組得分最高，第2亞組次之，第1亞組得分最低（圖2E-G）。
4. 代謝相關(guān)CpG特征的構(gòu)建
為了簡化實(shí)際應(yīng)用中的分組，研究者構(gòu)建了代謝相關(guān)CpG特征的分組相關(guān)評分方案。為了構(gòu)建特征，首先對代謝相關(guān)CpG亞組進(jìn)行差異甲基化分析。在所有可能的比較中差異甲基化的CpG被認(rèn)為是亞組相關(guān)CpG。最終，確定了213個與亞組相關(guān)的CpGs（圖3A、B）。接下來，對這些亞組相關(guān)CpGs進(jìn)行Lasso回歸分析（圖3C）。結(jié)果生成了由七個CpGs組成的CpG特征（圖3D）。計算了所有TCGA樣本的風(fēng)險得分。分析表明，風(fēng)險評分在三個亞組之間的分布存在顯著差異。大多數(shù)第3分組LGG被分配到高風(fēng)險組，而第1分組和第2分組LGG大部分被分配到低風(fēng)險組（圖3E、F）。然后評估了該特征的預(yù)后意義。TCGA隊(duì)列首先分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。生存分析證實(shí)該特征可以對LGG患者的預(yù)后進(jìn)行分層（圖4A）。ROC曲線表明，該特征具有很強(qiáng)的預(yù)測能力（預(yù)測3年生存率為0.853，預(yù)測5年生存率0.815），并且表現(xiàn)優(yōu)于常見的臨床特征，如IDH突變、分級和年齡（圖4B）。
5. CpG特征的外部數(shù)據(jù)驗(yàn)證
接下來，在GEO和CGGA隊(duì)列中進(jìn)行外部驗(yàn)證。研究者計算了GEO隊(duì)列中所有患者的風(fēng)險分?jǐn)?shù)，并將他們分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。Kaplan-Meier分析證實(shí)了該特征的預(yù)后意義（圖4C）。雖然ROC分析顯示，代謝CpG特征在預(yù)測3年P(guān)FS方面具有良好的預(yù)后能力（AUC=0.747），但在預(yù)測5年P(guān)FS（AUC=0.66）方面表現(xiàn)不佳，但其表現(xiàn)優(yōu)于常見臨床特征，如年齡、分級和IDH突變（圖4D）。隨后也在CGGA隊(duì)列中進(jìn)行間接外部驗(yàn)證，以構(gòu)建基因特征作為替代。具體而言，篩選了與風(fēng)險評分呈強(qiáng)線性相關(guān)的基因，然后使用Lasso回歸將這些基因與風(fēng)險評分進(jìn)行擬合。隨后，生成了代替CpG特征，由48個基因組成的基因特征（圖4E）。使用該替代基因特征計算的風(fēng)險得分與使用CpG特征計算的得分具有很強(qiáng)的相關(guān)性（圖4F）。然后，使用基因特征計算CGGA隊(duì)列的風(fēng)險得分。Kaplan-Meier分析（圖4G）和ROC曲線（圖4H）分析結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)集基本一致；預(yù)測3年OS的AUC為0.83，預(yù)測5年OS的AUC為0.754。結(jié)果表明，該特征適用于更廣泛的隊(duì)列。
6. 代謝CpG特征的表征
研究者研究了風(fēng)險評分與常見預(yù)后變量或分子亞類的相關(guān)性，包括組織學(xué)分級、IDH突變等。觀察到，風(fēng)險評分在按這些常見變量或子類別分層的亞組之間的分布存在顯著差異（圖5A-H）。該特征能夠進(jìn)一步分層這些分層的亞組（圖6A-L）。為了更好地理解代謝CpG特征的生物學(xué)基礎(chǔ)，對每個CpG進(jìn)行了功能表征，發(fā)現(xiàn)cg10054641位于基因啟動子區(qū)，位于TMEM71的TSS200。為了研究cg10054641是否調(diào)節(jié)TMEM71的表達(dá)，計算了cg1005464甲基化與TMEM71表達(dá)之間的Kendall相關(guān)性。結(jié)果顯示出強(qiáng)烈的負(fù)相關(guān)性，表明cg10054641負(fù)調(diào)節(jié)TMEM71的表達(dá)（圖7G）。為了對位于非啟動子區(qū)的特征性CpG進(jìn)行功能分析，篩選了與這些CpG具有強(qiáng)相關(guān)性的基因，并進(jìn)行了GO富集分析。結(jié)果顯示，cg00347746與主要與正常細(xì)胞功能相關(guān)的基因相關(guān)，如突觸活動（圖7A），cg00301239與參與細(xì)胞分化、增殖和RNA處理的基因相關(guān)（圖7B），cg02518245、cg04003582、cg25205489和cg27305460與RNA代謝相關(guān)的基因相關(guān)（圖7C-E）。接下來，使用“l(fā)imma”R軟件包，對高危組與對照組進(jìn)行了差異表達(dá)分析。在兩組之間確定了2028個DEG。在根據(jù)這些DEG的logFC值對其進(jìn)行排序后，對這些DEG進(jìn)行了GSEA。結(jié)果顯示，高危人群的細(xì)胞周期和免疫相關(guān)過程顯著豐富（圖7H）。
Qilu cohort的免疫組織化學(xué)結(jié)果還顯示，風(fēng)險評分較高的腫瘤更有可能具有較高的Ki-67陽性率，進(jìn)一步證實(shí)了風(fēng)險評分與增殖活性相關(guān)（圖8A）?；钴S的細(xì)胞有絲分裂與高突變負(fù)荷和免疫浸潤相關(guān)。為了研究不同風(fēng)險群體的突變特征，對來自TCGA隊(duì)列的體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間的突變頻率存在顯著差異（圖8B）。與低風(fēng)險組相比，細(xì)胞增殖活躍的高風(fēng)險組與更高的突變頻率顯著相關(guān)。接下來，還探討了高危組和低危組的突變模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間存在明顯的突變模式。IDH1、ATRX、CIC、FUBP1和NOTCH1在低風(fēng)險組中具有顯著較高的突變率，而TTN、EGFR和PTEN，NF1（36.6 vs.4.7%，p<0.001）在高危組中具有顯著較高的突變率（圖8C）。
7. 代謝CpGs特征預(yù)測免疫浸潤和潛在的免疫治療反應(yīng)
還評估了代謝CpG特征與免疫浸潤之間的關(guān)聯(lián)。首先，使用MCP-Counter量化了8個主要免疫亞群，并研究了它們與風(fēng)險評分的相關(guān)性。注意到風(fēng)險評分伴隨著明顯的免疫浸潤。與低風(fēng)險組相比，高風(fēng)險亞組的抗腫瘤細(xì)胞亞群（如T細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞）浸潤水平顯著較高（圖9A）。接下來，用ssGSEA算法量化了28個免疫亞群。觀察到類似的結(jié)果。高危組的活化CD4 T細(xì)胞、活化CD8 T細(xì)胞、激活樹突狀細(xì)胞、中樞記憶CD8 T淋巴細(xì)胞等水平顯著升高（圖9B）。免疫檢查點(diǎn)在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能中起著重要作用。靶向ICIs的治療被認(rèn)為是最有前途的抗腫瘤治療。鑒于代謝CpG特征伴隨著不同的突變負(fù)荷和免疫浸潤模式，這是ICI治療反應(yīng)的預(yù)測因子，假設(shè)代謝CpG特征也可能與ICI治療的反應(yīng)相關(guān)。因此，探討了高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間不同的免疫浸潤模式是否伴隨著ICI水平的差異。與低風(fēng)險組相比，高風(fēng)險組的PD-L1（CD274）、CTLA-4和HAVCR2水平顯著較高（圖9D）。此外，使用IPS算法量化了潛在的免疫治療反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)高危組的IPS顯著升高，這表明高危組患者更有可能對免疫治療產(chǎn)生反應(yīng)（圖9C）。總的來說，代謝CpG特征可以作為預(yù)測患者對ICI治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物。
四、總結(jié)
綜上所述，該工作從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和甲基化數(shù)據(jù)的角度探討了代謝重編程與DNA甲基化之間的關(guān)系，并基于這種關(guān)系進(jìn)行了分析。確定了LGG中三個代謝相關(guān)的DNA甲基化亞組，并構(gòu)建了一個CpG特征，以對預(yù)后進(jìn)行分層并預(yù)測對ICI的反應(yīng)。該文章逐步闡述各個不同亞型之間的特征，即使沒有進(jìn)行了濕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但文章故事邏輯清晰合理，所以也可以發(fā)到6+。
