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circRNA的常規(guī)分析思路也可以乘風破浪，斬獲高分。近年來，circRNA像一顆冉冉升起的星星，受到廣大科研工作者的青睞，現(xiàn)在已經(jīng)到了炙手可熱的地步，細數(shù)近年來circRNA在國家自然科學基金獲批項目的情況，早就已經(jīng)成為非編碼RNA界的研究熱點。
文章簡介：
本篇文章1發(fā)表在Molecular Cancer上，在最近一年的影響因子為27.401比上一年增加了12.099。這篇文章發(fā)現(xiàn)并證明circRNF220對兒童AML的準確診斷可能是高效和特異的，并對復發(fā)預測有一定的意義。
背景知識：
環(huán)狀RNA(circRNAs)是一個具有獨特結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本家族，已被證實在腫瘤發(fā)生中起關鍵作用，是潛在的生物標志物或治療靶點。然而，在兒童急性髓系白血病(AML)中，只有少數(shù)circRNA具有功能特征。
思路總結(jié)：
結(jié)果解讀：
散點圖可視化顯示，circRNA的表達水平是可變的，并且在不同的組之間是可以區(qū)分的(Fig.1A)。共有1,960個circRNA在急性髓系白血病和對照樣本之間差異表達，其中1001個circRNA表達上調(diào)，959個circRNA表達下調(diào)。染色體1和2含有大量差異表達的circRNA(Fig. 1B-C)。在急性髓系白血病中，大多數(shù)差異表達的circRNA是從外顯子轉(zhuǎn)錄而來的(Fig.1D)。大多數(shù)異常circRNA的長度小于1500個核苷酸，中位數(shù)長度為372個核苷酸(Fig.1E)。然后，通過系統(tǒng)聚類法確定了前10個上調(diào)和下調(diào)的circRNA (Fig. 1F)。綜上所述，作者觀察到在兒童原發(fā)性AML中circRNA表達的顯著差異，支持了研究circRNA在髓系白血病發(fā)生中作用的重要性。circRNF220是在廣泛的樣本驗證過程中確定的最佳候選(Fig.1G)。作者發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，原發(fā)性AML患者的circRNF220表達持續(xù)且顯著增加。值得注意的是，circRNF220在小鼠的各種組織中普遍表達，在骨髓、脾和肺等造血組織中高度富集(Fig. 1H)。此外，在作者調(diào)查的兒童白血病和其他血液系統(tǒng)疾病(包括ALL、MDS、JMML、CML、ITP、貧血、淋巴瘤和血小板減少癥)中，circRNF220在兒童AML中高表達(Fig. 1I)。
接下來，作者驗證了circBase數(shù)據(jù)庫和circBank數(shù)據(jù)庫中是否存在circRNF220?；蚪M結(jié)構(gòu)顯示，circRNF220位于1p34.1，含有一個較大的第二外顯子(742bp)，該外顯子來源于RNF220基因，右側(cè)有較長的內(nèi)含子(Fig.2A)。為進一步鑒定circRNF220，檢測cDNA和gDNA中的線性轉(zhuǎn)錄本。PCR結(jié)果表明，用不同的引物從cDNA中擴增出環(huán)狀條帶，但不能從gDNA中擴增出環(huán)狀條帶，而從cDNA和gDNA中擴增出環(huán)狀條帶(Fig. 2B)。然后作者研究了circRNF220在原代AML細胞中的穩(wěn)定性和定位。用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D處理后，在指定的時間點收集總RNA。對circRNF220和RNF220 mRNA的分析表明，circRNA亞型非常穩(wěn)定，轉(zhuǎn)錄本的半衰期超過48h，而線性轉(zhuǎn)錄本的半衰期為4h (Fig.2C)。QRT-PCR分析RNase R處理的AML細胞中circRNF220和RNF220 mRNA的豐度，證明circRNF220在形式上是圓形的(Fig. 2D)。此外，qRT–PCR分析細胞核和細胞質(zhì)circRNF220的表達，以及circRNF220的FISH結(jié)果表明，circRNF220優(yōu)先定位于細胞質(zhì)，當然也有適度的比例定位于細胞核(Fig. 2 E–F)。綜上所述，作者的結(jié)果表明，circRNF220是一種在兒童AML細胞中表達豐富且穩(wěn)定的circRNA。
鑒于circRNAs在白血病診斷和治療中的巨大作用，作者探討了circRNF220的臨床價值。作者首次發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，幾乎所有AML亞型(除M6/M7外)患者的circRNF220表達持續(xù)且顯著增加(Fig. 3A)。根據(jù)隊列中circRNF220表達的中位數(shù)水平，作者將兒童AML患者分為高表達組和低表達組，以確定circRNF220表達是否與臨床病理特征相關。然而，現(xiàn)有的病理數(shù)據(jù)并無顯著差異(Table 1)。接下來，作者進行ROC曲線分析，以檢驗circRNF220表達在AML患者與健康對照和其他血液病患者之間的潛在診斷價值(Fig.3B)。有趣的是，研究結(jié)果表明，circRNF220在急性髓系白血病患者的外周血樣本中也有明顯較高的表達(Fig.3C)。此外，應用ROC曲線分析檢測外周血中circRNF220表達的潛在診斷價值(Fig. 3D)。提示無論是骨髓還是外周血中的circRNF220都有相當大的潛力作為診斷生物標志物。為了確定影響AML預后的生物學機制，作者驗證了RNF220在不同治療階段AML患者中的表達。在新診斷的AML患者中，circRNF220的表達水平明顯高于健康對照組(Fig. 3E)。Wilcoxon符號秩檢驗結(jié)果顯示，幾乎所有配對的CR樣本中，circRNF220的表達都顯著降低(Fig. 3F)。這些結(jié)果證實了circRNF220在AML進展階段的動態(tài)表達，提示其在白血病的發(fā)生和復發(fā)中可能起著復雜的作用。在對這些患者進行隨訪后，作者發(fā)現(xiàn)在確診時復發(fā)患者的circRNF220表達幾乎是其余持續(xù)CR患者的2.5倍(Fig. 3G)。作者觀察到在診斷時高表達的RNF220患者的RFS率(79.07%)低于低RNF220表達的患者(Fig.3H)。作者得出的結(jié)論是，初診時的circRNF220表達水平是兒童AML患者復發(fā)的獨立和可靠的預測因子。
接下來，作者試圖研究circRNF220對白血病細胞增殖和凋亡的影響。如圖所示(Fig.4A), circRNF220過表達顯著加速AML細胞增殖。此外，circRNF220的上調(diào)顯著降低了G0/G1期細胞的百分率，增加了S期和G2/M期細胞的百分率(Fig.4B-C)。值得注意的是，circRNF220的過表達導致更大的核質(zhì)比和更少的分葉狀核，表現(xiàn)出未成熟的外觀(Fig.4D)和下調(diào)THP-1細胞CD11b和CD14的表達(Fig.4E-F)。通過不同的檢測方法觀察到急性髓系白血病細胞系的凋亡顯著減少(Fig. 4G-I)。有趣的是，原代AML細胞在circRNF220 kD后，Annexin V染色顯示細胞總數(shù)減少，凋亡迅速(Fig. 4J-K)。這些數(shù)據(jù)共同表明了circRNF220在急性髓系白血病中的功能相關性。
為了明確circRNF220在AML細胞中的轉(zhuǎn)錄功能，作者利用RNA-seq技術分析了3例兒童AML患者在LV-sh-circRNF220感染后原代細胞中的基因表達。共有107個mRNA(62個下調(diào)，45個上調(diào))在所有三個樣本(Fig. 5A-B)。為了確定circRNF220調(diào)控的分子途徑，作者對常見的異常轉(zhuǎn)錄本進行了KEGG分析。作者觀察到與細胞凋亡、溶酶體和急性髓系白血病相關的基因正向富集(Fig. 5C)。作者還應用GSEA來識別由circRNF220缺失而產(chǎn)生的不同調(diào)節(jié)通路，并發(fā)現(xiàn)所有三名AML患者共有的幾條GSEA通路在統(tǒng)計學上顯著失調(diào)。參與發(fā)育的凋亡過程也有顯著的P值和歸一化富集分數(shù)1.34(Fig. 5D)。作者在AML-E697細胞中獨立評估了幾個凋亡相關基因(Fig. 5E)。發(fā)現(xiàn)AKT、XIAP、ARF1、BAG5等抑制凋亡基因的表達明顯下調(diào)，促凋亡基因BIM表達上調(diào)(Fig.5F)。值得注意的是，作者還顯示，造血功能的標準富集分數(shù)為-1.26 (Fig.5G)。然后作者想知道在AML復發(fā)過程中，circRNF220是否與克隆群體的豐富或維持有關，通過對文獻的系統(tǒng)回顧，作者調(diào)查了與AML復發(fā)相關的一個潛在的基因圖譜。作者從作者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中驗證了HL-60過表達系統(tǒng)中與復發(fā)有關的差異表達基因 (Fig. 5H-I)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，circRNF220在細胞凋亡和AML復發(fā)中起著重要作用。
由于circRNAs通常通過與miRNAs相互作用發(fā)揮作用，因此作者尋找與circRNF220相互作用的候選miRNAs。通過計算預測，作者確定了5個候選者(miR-30a/b/c/d/e)。它們的預測結(jié)合位點位于circRNF220中高度保守的AGO-binding位點內(nèi)(Fig. 6A)。利用作者隊列中的一個子集(n=36)的miRNA表達數(shù)據(jù)，作者分析了這些miRNA和circRNF220表達之間的相關性。只有一種miRNA miR-30a的表達與circRNF220的表達顯著相關.(Fig. 6B) 正如預期的那樣，circRNF220kD增加了AML細胞中miR30a的豐度(Fig. 6C) 隨后，作者進行了RNA下拉實驗，觀察到miR-30a在原代AML細胞和AML細胞系中顯著富集 (Fig.6D)。然后作者增強miR-30a的表達，發(fā)現(xiàn)miR-30a 的過表達在AML細胞中與陰性對照細胞相比顯著降低了癌基因EKL3和IER2的豐度(Fig. 6E)。與miR-30a在RNF220kD附近上調(diào)一致，ELK3和IER2的豐度顯著降低 (Fig. 6F)。同樣，除BIM外，其他靶基因，如GLUD2和MYSM1，在miR-30a OE細胞和circRNF220 kD細胞中均下調(diào)。(Fig. 6E-F) 接下來，作者應用GSEA找出了受circRNF220抑制的不同調(diào)控通路，發(fā)現(xiàn)miR-30靶分子顯著下調(diào)，這與上面的發(fā)現(xiàn)是一致的(Fig. 6G)。為了解AML患者中circRNF220和miR-30a靶基因之間的關系，作者發(fā)現(xiàn)ELK3、IER2、GLUD2和MYSM1在初發(fā)AML患者和復發(fā)患者的評估樣本中的相對豐度始終高于CR患者和健康對照組的樣本(Fig. 6H)。此外，miR-30a的OE可顯著抑制由增強circRNF220表達所誘導的HL-60和K562細胞的增殖(Fig. 6I-J)。重要的是，經(jīng)miR-30a處理的HL-60細胞有明顯的凋亡跡象，并且通過轉(zhuǎn)染miR-30a可以恢復由circRNF220的OE誘導的HL-60細胞凋亡的顯著增加(Fig. 6K)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，circRNF220可能作為內(nèi)源性miR-30a海綿隔離miR-30a并抑制其活性，從而導致其下游靶標水平的增加，包括MYSM1和IER2。
全文小結(jié)：
作者發(fā)現(xiàn)了一種circRNA，circRNF220，它在AML患兒的外周血和骨髓中特異性地豐富和積累，具有較高的敏感性和特異性。值得注意的是，circRNF220的表達獨立預測預后，而circRNF220的高表達是復發(fā)的不良預后標志。從機制上講，circRNF220可能作為miR-30a的內(nèi)源性吸附海綿，隔離miR-30a并抑制其活性，從而增加其靶基因MYSM1和IER2的表達，參與AML的復發(fā)。
參考文獻
1. Liu X, Liu X, Cai M, et al. CircRNF220, not its linear cognate gene RNF220, regulates cell growth and is associated with relapse in pediatric acute myeloid leukemia. Mol Cancer 2021; 20(1): 139.
