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A Bioinformatics Evaluation of the Role of Dual-Specificity Tyrosine-Regulated Kinases in Colorectal Cancer
生物信息評(píng)估雙特異性酪氨酸調(diào)節(jié)激酶在結(jié)直腸癌中的作用
一、研究背景
結(jié)直腸癌(CRC)是全球第三大常見癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，其在年輕人群中的發(fā)病率也在不斷上升。研究發(fā)現(xiàn)雙特異性酪氨酸調(diào)節(jié)激酶(DYRK)家族與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病有關(guān)。然而，不同家族成員在調(diào)控CRC腫瘤發(fā)生中的作用和貢獻(xiàn)尚未不清楚。因此，文章利用公開的CRC患者數(shù)據(jù)集和生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)工具進(jìn)行計(jì)算分析，對(duì)DYRK家族成員的表達(dá)模式、預(yù)后價(jià)值以及在CRC腫瘤中的作用進(jìn)行研究。最終揭示了不同DYRK家族成員在CRC中的作用及其潛在的預(yù)后價(jià)值。
二、數(shù)據(jù)及方法
1. Genotype-Tissue Expression（GTEx）：為了測(cè)量正常結(jié)腸組織中DYRKs的表達(dá)水平，文章使用了基因組織表達(dá)(GTEx)工具，其提供了不同非病變組織中特定基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。文章查詢了乙狀結(jié)腸和橫結(jié)腸組織的DYRKs成員表達(dá)。
2. GENT2：為了測(cè)量不同CRC亞型中DYRKs的表達(dá)水平，作者使用GENT2數(shù)據(jù)庫(kù)，通過亞型標(biāo)簽研究了DYRKs在CRC分子亞型中的表達(dá)。
3. Gene Expression Profiling Interactive Analysis2 （GEPIA2）：為了測(cè)量不同CRC分期的DYRKs表達(dá)水平，作者使用GEPIA2工具，通過分期標(biāo)簽查詢每個(gè)DYRK基因，并使用該工具生成CRC患者DYRK的總生存K-M曲線，同時(shí)采用Cox回歸分析計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比。
4. cBioPortal：為了進(jìn)一步分析腫瘤樣本中DYRKs的狀態(tài)，文章使用cBioPortal基因特異性查詢，對(duì)于每個(gè)DYRK基于z-score對(duì)樣本進(jìn)行過濾。
5. GeneSet Cancer Analysis（GSCALite）：Gene Set Cancer Analysis (GSCALite)可以預(yù)測(cè)癌癥相關(guān)通路的基因活性，作者使用該工具研究了來(lái)自TCGA的結(jié)腸腺癌(COAD)數(shù)據(jù)集中DYRKs在癌癥相關(guān)通路中的作用。
6. STRING：文章使用STRING工具預(yù)測(cè)了DYRKs的功能蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，其中只選擇實(shí)驗(yàn)蛋白、數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白和共表達(dá)蛋白。
7. TIMER2：TIMER 2能夠使用多種算法分析和測(cè)量TCGA數(shù)據(jù)集中的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞。該工具測(cè)量感興趣基因表達(dá)和免疫浸潤(rùn)細(xì)胞豐度之間的相關(guān)性。作者利用這個(gè)工具來(lái)研究CRC中DYRKs與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的相關(guān)性。
8. UALCAN：UALCAN使用來(lái)自TCGA、MET500和CPTAC等癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)的多組學(xué)數(shù)據(jù)，研究不同癌癥的表達(dá)、甲基化等基因狀態(tài)與生存的相關(guān)性。作者使用該工具研究了DYRKs在正常和腫瘤樣本中的表達(dá)，并研究了CRC TCGA數(shù)據(jù)集中DYRKs啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。
三、主要內(nèi)容及結(jié)果
1. DYRKs在結(jié)腸組織中的表達(dá)
文章第一部分作者使用GTEx研究了DYRKs在正常結(jié)腸組織中乙狀結(jié)腸和橫結(jié)腸兩個(gè)解剖部位的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)如圖1所示，在結(jié)腸的兩個(gè)解剖部位，與其他DYRKs相比，DYRK1A在結(jié)腸組織中都有較高的表達(dá)水平。DYRK1B和DYRK2在結(jié)腸組織中呈中度表達(dá)，而DYRK3和DYRK4在結(jié)腸組織中低表達(dá)。
2. DYRKs基因在正常與結(jié)腸和直腸腺癌組織中的表達(dá)
接下來(lái)，作者評(píng)估了DYRKs在結(jié)腸和直腸腺癌（COAD）和直腸腺癌（READ）與正常組織的表達(dá)水平。作者使用UALCAN 工具中的TCGA RNA-seq數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)DYRK1A和1B沒有顯著變化(圖2a,b)，而DYRK2(圖2c)在COAD樣本中相比于正常組織有顯著的低表達(dá)。另一方面，與正常組織相比，DYRK3(圖2d)和DYRK4(圖2e)在COAD樣本中均發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)。如圖3所示，與正常組織相比，DYRK1A(圖3a)和DYRK2(圖3c)在READ腫瘤組織中的表達(dá)均顯著降低，而DYRK1B、DYRK3和DYRK4的表達(dá)無(wú)顯著變化。
3. DYRKs在CRC分子亞型中的表達(dá)水平
這一部分作者對(duì)結(jié)直腸癌主要病理分子亞型中DYRKs的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。第一組是微衛(wèi)星不穩(wěn)定組(MSI)，第二組是微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)。MSS CRC以APC、TP53、PIK3CA、KRAS和SMAD4等多個(gè)基因的高體細(xì)胞突變率為特征。為了研究DYRK成員在不同腫瘤亞型中的基因表達(dá)，作者使用了基于網(wǎng)絡(luò)的工具GENT2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSI與MSS亞型相比，DYRK1A、DYRK3和DYRK4(圖4a、d、e)在MSI中均顯著升高，而DYRK2在MSS中顯著升高(圖4c)。DYRK1B在MSI和MSS中的表達(dá)無(wú)顯著差異(圖4b）。
4. DYRKs在CRC分期中的表達(dá)水平
接下來(lái)作者利用GEPIA2，探索了不同CRC分期的DYRKs成員的水平，結(jié)果如圖5所示，可以觀察到從IIIA到IVB期，DYRK1A在腫瘤晚期顯著上調(diào)(圖5a)。DYRK1B表達(dá)在CRC分期間無(wú)顯著差異(圖5b)。同樣，2類DYRKs表達(dá)在CRC分期中無(wú)顯著差異。這表明在DYRKs成員中，只有DYRK1A在CRC患者腫瘤晚期過表達(dá)，提示DYRK1A可能在疾病晚期發(fā)揮作用。
5. 結(jié)直腸癌中DYRKs的臨床特點(diǎn)
在這一部分，作者進(jìn)一步探索DYRK成員表達(dá)水平和CRC臨床特征之間的關(guān)系。作者首先使用cBioPortal基于DYRK成員表達(dá)過濾樣本。接著分析了DYRKs和組織學(xué)癌癥亞型之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與從UALCAN觀察到的一致，DYRK3和4的表達(dá)水平在大多數(shù)腫瘤樣本中都很高，且作者也發(fā)現(xiàn)DYRK1A高表達(dá)樣本與粘液性結(jié)直腸腺癌顯著相關(guān)（圖6a）。
DYRK4也得到了類似結(jié)果如圖6d所示。另一方面，DYRK1B在非粘液性COAD中的表達(dá)高于粘液性COAD亞型(圖6b)。對(duì)于DYRK3，其在所有三個(gè)組織學(xué)亞型中的表達(dá)均無(wú)顯著變化(圖6c)。此外作者也分析了DYRKs和轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)分期及治療后新腫瘤事件的關(guān)系。結(jié)果如圖7所示，與正常組織相比，DYRK1A在CRC中低表達(dá)，但DYRK1A高表達(dá)的腫瘤樣本在轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)晚期富集(圖7a,b)。對(duì)于其他DYRKs成員，其表達(dá)與轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)分期之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖7c-h)。此外，腫瘤樣本中DYRK1A水平越高，初始治療后腫瘤復(fù)發(fā)越高(圖8a)。而其他DYRKs成員均未出現(xiàn)任何顯著變化(圖8b-d)。這些結(jié)果表明，DYRK1A可能作為CRC疾病晚期的潛在腫瘤生物標(biāo)志物。
6. CRC中DYRKs的突變和啟動(dòng)子甲基化
由于先前分析發(fā)現(xiàn)CRC中DYRKs在正常與腫瘤中有差異表達(dá)。作者為了確定這種表達(dá)變異是否與特定突變有關(guān)，使用cBioPortal分析了TCGA中的DYRKs突變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)如圖9所示，DYRKs在CRC中一般未發(fā)生突變，部分樣本存在DYRK1B、DYRK3、DYRK4的擴(kuò)增突變。對(duì)于DYRK1A，存在一個(gè)意義未知的錯(cuò)義突變。總的來(lái)說(shuō)，作者發(fā)現(xiàn)DYRKs的差異表達(dá)與mRNA水平有關(guān)。接下來(lái)作者使用UALCAN研究不同腫瘤分期中DYRKs基因啟動(dòng)子的甲基化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在COAD中DYRK1A的甲基化水平?jīng)]有明顯變化(圖10a)，而在READ中，與正常樣本相比，3期的甲基化水平明顯降低(圖10b)。與正常的COAD相比，DYRK1B的甲基化在1、2和3期顯著增加(圖10c)，在READ中，與正常樣本相比，甲基化在1期顯著增加，在第4期顯著降低(圖10d)。且DYRK2僅在COAD的4期甲基化水平較低(圖10e)，而在READ中未觀察到顯著變化(圖10f)。作者研究正常與腫瘤樣本的mRNA表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)在COAD中DYRK3(圖10g)和DYRK4(圖10i)的甲基化水平明顯低于對(duì)照組。在READ中，只有DYRK4在1和4期中甲基化水平較低(圖10i)。這些結(jié)果表明，正常與腫瘤中DYRKs表達(dá)的差異可能與表觀遺傳調(diào)控有關(guān)，而不是基因突變。
7. DYRKs在CRC中癌癥相關(guān)通路中的活性
這一部分，在探索了DYRKs在CRC臨床特征中的狀態(tài)后，作者使用GSCALite預(yù)測(cè)DYRKs在COAD中的分子功能（圖11）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1類DYRKs (1A和1B)和DYRK4與細(xì)胞周期抑制相關(guān)。然而，DYRK1B也與凋亡抑制、DNA損傷反應(yīng)和PI3K/AKT通路激活相關(guān)。DYRK2與抑制DNA損傷反應(yīng)相關(guān)，而DYRK3與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和雌激素通路正相關(guān)。這些表明DYRKs可能在多個(gè)癌癥相關(guān)通路中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步預(yù)測(cè)DYRKs在癌癥中的功能，作者使用STRING來(lái)預(yù)測(cè)DYRKs的相互作用對(duì)，發(fā)現(xiàn)DYRK1A與參與細(xì)胞周期抑制的DREAM復(fù)合體相互作用。此外，它與參與DNA損傷反應(yīng)的泛素連接酶RNF169相互作用。作者也發(fā)現(xiàn)DYRK1B與信號(hào)誘導(dǎo)增殖相關(guān)，這預(yù)測(cè)了它在DNA損傷中的作用。DYRK1B的另一個(gè)相互作用因子是LZTS2，它是β - catenin的負(fù)調(diào)控因子，提示它與結(jié)直腸癌有關(guān)。最后，作者發(fā)現(xiàn)所有DYRK成員都與DCAF7有功能關(guān)聯(lián)。
8. CRC患者DYRKs與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的相關(guān)性研究
接下來(lái)作者使用TIMER 2來(lái)探索CRC 中DYRKs表達(dá)和腫瘤浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞之間潛在的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)如圖12所示，DYRK1A與CD4+ T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和髓樣樹突狀細(xì)胞呈顯著正相關(guān)，與CD8+ T細(xì)胞和B細(xì)胞無(wú)顯著相關(guān)。對(duì)于DYRK1B，只發(fā)現(xiàn)與CD4+ T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞有顯著正相關(guān)。雖然DYRK2在MSS亞型中表達(dá)較高，但其表達(dá)與CD8+ T細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、髓樣樹突狀細(xì)胞呈正相關(guān)。此外，DYRK3也被發(fā)現(xiàn)與CD8+ T細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和髓樣樹突狀細(xì)胞呈正相關(guān)。DYRK4與免疫浸潤(rùn)細(xì)胞無(wú)顯著相關(guān)性。綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)只有DYRK1A和DYRK3在MSI亞型中表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)與免疫浸潤(rùn)細(xì)胞呈正相關(guān)。
9. 無(wú)進(jìn)展生存率（PFS）
這一部分作者基于來(lái)自cBioPortal的Pan TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DYRK1A高表達(dá)的CRC樣本PFS顯著較低(圖13a)。然而，對(duì)于其他DYRKs，未觀察到PFS的顯著變化(圖13b-d)。這些結(jié)果與上述一致，進(jìn)一步支持了DYRK1A在晚期CRC腫瘤中的表達(dá)可能反映患者預(yù)后不良的觀點(diǎn)。
10. 總體生存（OS）
在最后一部分，作者為了進(jìn)一步證實(shí)在cBioPortal中的發(fā)現(xiàn)，對(duì)總生存期進(jìn)行了Kaplan-Meier分析。結(jié)果觀察到DYRK1A表達(dá)較高的CRC患者總生存期明顯較低(圖14a)，而其他DYRK成員與總生存期沒有任何顯著相關(guān)性(圖14b-f)。這表明DYRK1A的表達(dá)不同于其他DYRK成員，可以預(yù)測(cè)CRC中的癌癥生存期。
到這里這篇文章的主要內(nèi)容就介紹完了，文章從DYRK家族入手，整合并利用多個(gè)工具及數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合甲基化、突變、表達(dá)等數(shù)據(jù)分析了DYRK與CRC的預(yù)后、臨床特征等的關(guān)系。同時(shí)文章也涉及了DYRK與免疫及功能等相關(guān)分析，文章的內(nèi)容豐富，角度全面，條理清晰，這種思路及方法非常值得我們學(xué)習(xí)借鑒，選對(duì)角度利用好這些工具及數(shù)據(jù)庫(kù)，不用怎么敲代碼也可以發(fā)6+，簡(jiǎn)直是生信小白的福利呀。
參考文獻(xiàn)
A Bioinformatics Evaluation of the Role of Dual-Specificity Tyrosine-Regulated Kinases in Colorectal Cancer.
