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如火如荼的空間轉(zhuǎn)錄組，你拿捏了嗎？ — 泛癌分析揭示癌細胞的出現(xiàn)機制

生信干貨 MNR ·2023年3月31日 09:25

空間轉(zhuǎn)錄組研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展的具體機制，真是適配度極高，思路清晰!作為空間轉(zhuǎn)錄組的頭號粉絲，小編已經(jīng)于上期（生信人公眾號，3.23期）分享了高手如何分析“腫瘤”的前世今生！把從癌前病變到惡性腫瘤轉(zhuǎn)化機制分析，安排的明明白白！

今天小編給大家分享“腫瘤的前世今生之——復發(fā)機制”，我們先從一篇高分泛癌分析說起!文章結(jié)尾有彩蛋，重在將高大上的“空間轉(zhuǎn)錄組”思路拆解，好為我們普通人所用，大家不要錯過哦!

今天分享的文章于2022年8月發(fā)表在 nature genetics （IF：41.307）， 題目“癌細胞狀態(tài)在腫瘤類型中反復出現(xiàn)，并與腫瘤微環(huán)境形成特定的相互作用Cancer cell states recur across tumor types and form specific interactions with the tumor microenvironment”

作者對15種癌癥類型進行了泛癌單細胞RNA測序分析，并確定了一個基因模塊目錄，其表達定義了復發(fā)的癌細胞狀態(tài)，包括應激、干擾素反應、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、金屬反應、基底和纖毛等。通過空間轉(zhuǎn)錄組分析（10x Genomics Visium）和多色免疫熒光（AKOYA CODEX）將腫瘤細胞中的干擾素反應和腫瘤微環(huán)境中的T細胞和巨噬細胞聯(lián)系起來。利用小鼠模型，研究團隊進一步發(fā)現(xiàn)干擾素反應模塊的誘導因腫瘤位置的不同而異，并在淋巴細胞消除后減少。本文的發(fā)現(xiàn)拓展了人們對TME中癌細胞狀態(tài)與非惡性細胞類型之間關(guān)系的認識，為研究癌細胞狀態(tài)如何與腫瘤微環(huán)境相互作用，從而形成能夠進行免疫逃避、耐藥和轉(zhuǎn)移的有組織系統(tǒng)提供了一個框架。

一、背景

癌癥的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性越來越被認為是腫瘤進展、轉(zhuǎn)移和治療失敗的驅(qū)動因素。惡性腫瘤細胞的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性在一些癌癥類型中得到研究，并被定義為癌細胞狀態(tài)；然而，目前還不清楚這些狀態(tài)在多大程度上跨越腫瘤類型，構(gòu)成癌癥的一般特征。因此，需要比較不同的腫瘤類型來尋找腫瘤異質(zhì)性的共同點，并系統(tǒng)地研究癌細胞狀態(tài)和腫瘤微環(huán)境(TME)中非癌細胞類型之間的關(guān)系。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序使單個腫瘤細胞的無偏倚轉(zhuǎn)錄組分析成為可能，并揭示同一腫瘤的惡性細胞之間的異質(zhì)性。結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組測序和多色免疫熒光分析使TME的特定細胞類型與癌細胞狀態(tài)之間的因果關(guān)系變得更清晰明了。

二、結(jié)果

1、復發(fā)性腫瘤基因模塊鑒定

作者首先將收集的19例未經(jīng)治療直接手術(shù)切除的新鮮原發(fā)腫瘤，直接進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。收集的腫瘤包括9種癌癥類型:卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌、腎癌、肝癌、結(jié)腸癌和胰腺癌、胃腸間質(zhì)瘤。既往發(fā)表的腫瘤(包括其他PDAC和LIHC)以及其他腫瘤類型: 如膽管癌、肺腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌、多形性膠質(zhì)母細胞瘤和少突膠質(zhì)細胞瘤。接下來借助文獻檢索獲得的細胞類型標志基因及singleR軟件進行細胞類型注釋，區(qū)分惡性細胞與非惡性細胞。細胞主要被注釋為上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、髓樣細胞、B細胞、T細胞以及自然殺傷細胞。而后，進一步借助標志基因、異常的拷貝數(shù)狀態(tài)和腫瘤間異質(zhì)性對惡性細胞進行識別（圖1c）。最終結(jié)果得到了來自62個未經(jīng)治療的原發(fā)腫瘤的共19,942個惡性細胞，涉及15種癌癥類型。

接著，作者進一步用非負矩陣分解(NMF)分析惡性細胞，并通過在基因模塊水平進行整合，比對分析共得到16個具有跨癌種表達特征模塊的目錄，模塊中的基因數(shù)量范圍為9~297個基因。在進行跨組織和跨癌種的基因模塊離散度評估之后，發(fā)現(xiàn)一些模塊在多種不同器官系統(tǒng)的癌癥中被廣泛檢測到，包括細胞周期、應激反應、干擾素反應、缺氧、氧化磷酸化，以及金屬硫蛋白反應。而另一些模塊則顯示器官系統(tǒng)特異性，比如肺泡模塊、纖毛相關(guān)基因模塊、基底細胞模塊、鱗狀細胞模塊、腺體模塊、星形膠質(zhì)細胞樣模塊、少突膠質(zhì)細胞樣模塊和神經(jīng)祖細胞樣模塊。此外，還包括2個與上皮細胞間質(zhì)化相關(guān)的模塊，即部分間質(zhì)模塊（pEMT）和完全間質(zhì)模塊（cEMT）。表明這些模塊并不是在癌癥中新產(chǎn)生的，而是原本存在于正常組織中，是在正常組織癌變過程中逐漸被選擇出來，并在癌癥中呈現(xiàn)出更多樣化的表達。

2、基因模塊的表達是癌細胞狀態(tài)的基礎

接著作者對每個惡性細胞的每個模塊的表達進行評分(圖2a)，以試圖了解基因模塊如何在單個細胞水平進行表征，并基于惡性細胞的模塊，對19例本研究測序的單細胞數(shù)據(jù)分數(shù)進行UMAP降維，然后用每個癌細胞中得分最高的模塊對細胞進行注釋。結(jié)果表明，癌細胞不再按照患者個體或癌癥類型進行聚集，而是按照其最高表達的模塊來聚集（圖2b、2c）。隨后，作者發(fā)現(xiàn)有些模塊呈現(xiàn)共表達，如pEMT與干擾素反應及應激反應模塊共表達（圖2a、2d）。以上結(jié)果表明，基于基因模塊定義的癌細胞狀態(tài)通常不代表特定的腫瘤實體。

由于一些模塊也存在于正常組織中，因而作者比較了正常組織和癌組織中表達每個模塊的細胞比例（圖2e）。觀察到在所有癌癥類型中，pEMT模塊在所有癌癥類型中表達的比例都大于其正常組織。LUAD、SKSC與其正常組織間鱗狀細胞模塊的細胞比例沒有差異，但PDAC中鱗狀細胞模塊的細胞比例升高，SKSC中腺體模塊的細胞比正常皮膚組織的比例高。這些變化都表明，癌癥組織中既保留了正常組織的模塊，又隨著疾病進展而表現(xiàn)出其他細胞類型的模塊。

3、空間腫瘤微環(huán)境探究

為了探究癌細胞狀態(tài)與TME中細胞類型的關(guān)系，作者對收集的10例未治療患者的新鮮原發(fā)腫瘤組織（OVCA∶UCEC∶BRCA∶PDAC∶GIST∶LIHC=2∶1∶3∶1∶2∶1）開展了空間轉(zhuǎn)錄組測序。作者使用來自成對單細胞數(shù)據(jù)的細胞類型的平均表達譜進行了非負線性最小二乘(NNLS)回歸，并將Spot標注為“惡性”(僅包含惡性細胞)、“正?！?僅包含免疫細胞和基質(zhì)細胞)和“兩者”(包含惡性細胞，免疫細胞和基質(zhì)細胞組合)三個類型(圖3a)。作者發(fā)現(xiàn)，在含有惡性細胞的Spot中，內(nèi)皮細胞的比例較低(圖3b)，提示腫瘤的血管化不完全。相反，“兩者”Spot的中性粒細胞數(shù)量較多(圖3c)。腫瘤相關(guān)巨噬細胞被廣泛定義為M1(抗腫瘤，促炎)和M2(促腫瘤，抗炎)。對于每個含有巨噬細胞的Spot，作者對其M1/M2極性進行了評分(圖3d)。在6個婦科樣本(卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌)中，發(fā)現(xiàn)M1/M2中的“兩者”Spot高于“正?！盨pot，這表明在癌細胞附近具有強大的抗腫瘤免疫反應。

4、繪制癌細胞狀態(tài)及其與TME的相互作用

為了探究癌細胞鄰近區(qū)域的細胞組成及細胞間互作，作者描繪了每個空間轉(zhuǎn)錄組樣本中的癌細胞狀態(tài)，并根據(jù)每個模塊的表達對每個“惡性”Spot進行評分(圖4a)。為了表征每個“惡性”點周圍的細胞類型組成，作者計算了每個細胞類型的兩個評分指數(shù)，以在捕捉每個惡性細胞Spot的微環(huán)境特征。作者將“鄰域分數(shù)”定義為包含該細胞類型的周圍點所占的比例(圖4b)，通過直接量化相鄰點的細胞類型構(gòu)成來計算?！敖咏謹?shù)”的定義是通過的是感興趣Spot離每種類型細胞的直線距離來量化評估(圖4c)。

將每個腫瘤的“惡性”Spot的模塊評分和細胞類型的鄰域概況相關(guān)聯(lián)，以此揭示了TME的癌細胞狀態(tài)和細胞類型如何共定位形成“鄰域”(圖4d)。對于圖4a-c所示的BRCA NYU2腫瘤，關(guān)系熱圖中的一組包含干擾素應答模塊和巨噬細胞的定位。這一相關(guān)性的進一步研究也證實了模塊評分和巨噬細胞鄰域評分之間這種正相關(guān)關(guān)系的顯著性(圖4e)。使用接近評分計算巨噬細胞存在時，也觀察到一致的關(guān)系(圖4f)。為了在所有樣本中探索這一關(guān)系，作者計算了巨噬細胞鄰近區(qū)域的相關(guān)評分(圖4g)。在所有的樣本中，與干擾素反應的相關(guān)性都是正相關(guān)的，并且在10個樣本中有8個結(jié)果在統(tǒng)計學上表現(xiàn)為顯著。

將這一分析擴展到使用兩種測量的所有對細胞類型和模塊后(圖4h,4i)，作者發(fā)現(xiàn)與TME細胞類型一致的其他細胞狀態(tài)共定位。發(fā)生EMT的癌細胞與成纖維細胞和內(nèi)皮細胞呈正相關(guān)，而與其他惡性細胞呈負相關(guān)，這也與它們在腫瘤區(qū)域富集并與癌癥相關(guān)成纖維細胞相互作用的發(fā)現(xiàn)一致。除巨噬細胞外，表達干擾素應答的癌細胞與T細胞共定位(圖4h,i)。此外，作者還使用能夠在單細胞分辨率下進行空間分析的多重免疫熒光的方法——CODEX進行了驗證復現(xiàn)上述結(jié)論。以上結(jié)果都表明癌細胞狀態(tài)與TME的細胞組分密切相關(guān)，要么癌細胞狀態(tài)改變其周圍的細胞類型組成，要么TME中細胞類型誘導特定癌細胞狀態(tài)的產(chǎn)生。

5、腫瘤微環(huán)境擾動下的癌細胞狀態(tài)

為了測試干擾素反應與TME中T細胞之間的關(guān)系，使用異體移植小鼠模型進一步分析。首先，作者在具有正常免疫系統(tǒng)的小鼠腫瘤異體移植模型中進行腫瘤組織的scRNA-seq分析，結(jié)果表明，小鼠異體移植模型可以重現(xiàn)癌癥患者腫瘤樣本中存在的5個基因模塊：細胞周期、應激反應、干擾素反應、缺氧和腺體模塊。接下來，作者在缺乏T細胞和B細胞的Rag1-/-小鼠中進行腫瘤組織的scRNA-seq分析，結(jié)果顯示，細胞周期、應激反應、缺氧以及腺體模塊的表達頻率在野生型和Rag1-/-小鼠異體移植模型中沒有差別；與之相反的是，干擾素反應模塊的表達頻率在Rag1-/-小鼠異體移植模型中降低。此外，作者進一步發(fā)現(xiàn)干擾素反應模塊表達細胞的頻率也因腫瘤位置而異。這進一步通過實驗證明了干擾素反應的癌細胞狀態(tài)與TME中的T細胞相互作用。

三、討論和結(jié)論

文章的研究結(jié)果表明，導致腫瘤轉(zhuǎn)錄變異性的基本單位可以被認為是基因模塊，模塊間的組合產(chǎn)物定義了不同癌細胞狀態(tài)。在癌細胞間觀察到的許多異質(zhì)性似乎是由通常在其他細胞和發(fā)育環(huán)境中表達的模塊的重構(gòu)而造成的。相對于正常細胞，癌細胞利用現(xiàn)有的基因模塊，以不同的水平和更異質(zhì)性的方式重組表達。此外，作者發(fā)現(xiàn)參與干擾素應答的基因在該研究所囊括的15種癌癥類型的惡性細胞中被協(xié)同調(diào)節(jié)和異質(zhì)性表達，表明這種干擾素應答特殊表達的癌細胞狀態(tài)的存在是腫瘤發(fā)生的一個必要特征。本研究中對多種癌癥類型的癌癥狀態(tài)的觀察提供了證據(jù)，表明癌癥細胞狀態(tài)不是由遺傳定義的，而是其自身可塑性而導致的。雖然體內(nèi)的各癌細胞具有高度的可塑性，但它們的整體分布卻仍具有穩(wěn)定整體的特點。

思維擴展

小編來放彩蛋啦!大家發(fā)現(xiàn)了嗎，可以用的基因集又又又更新了??！

“作者確定了一個基因模塊目錄，其表達定義了復發(fā)的癌細胞狀態(tài)，包括應激、干擾素反應、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、金屬反應、基底和纖毛等”，既然是定義了腫瘤“復發(fā)”的基因集，那么就可以挪用到自己文章中，基于上述基因集表達情況，分析腫瘤復發(fā)傾向，是不是so easy!

當然，這只是開胃小菜！小編今天給大家整理了腫瘤空間轉(zhuǎn)錄組分析的一套流程，趕緊收藏吧！