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整合空間轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞測序揭示PDAC組織結(jié)構(gòu)
單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）能夠系統(tǒng)地識別組織中的細(xì)胞群，但描述其空間組織仍然具有挑戰(zhàn)性。2020年發(fā)表在Nature Biotechnology（IF=54.901）上的文章Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas，結(jié)合了基于微陣列的空間轉(zhuǎn)錄組（ST）方法，利用一系列spots揭示基因表達(dá)的空間模式。開發(fā)了Multimodal intersection analysis (MIA)多模式交叉分析，對原發(fā)性胰腺腫瘤應(yīng)用發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和癌細(xì)胞的亞群具有空間限制。此外，還識別出表達(dá)應(yīng)激反應(yīng)基因模塊的炎癥性成纖維細(xì)胞和癌細(xì)胞的共定位。
結(jié)果一：用 scRNA-seq 識別 PDAC 中的細(xì)胞群
首先收集了兩個未經(jīng)治療的PDAC患者的新鮮原發(fā)腫瘤，用于平行scRNA-seq和ST分析。scRNA-seq 數(shù)據(jù)每個細(xì)胞具有大約 2500 到 3300 個UMI 和大約 1400 到 1700 個唯一表達(dá)的基因。分別確定了PDAC-A和PDAC-B腫瘤中的15種和11種不同的種群，共享的細(xì)胞類型的基因表達(dá)特征顯示患者樣本之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性，驗(yàn)證了對樣本群集的注釋?；趕cRNA-seq的拷貝數(shù)變異（CNV）分析區(qū)分PDAC癌細(xì)胞和非惡性導(dǎo)管細(xì)胞。對于每個已識別的細(xì)胞類型推斷染色體擴(kuò)增和缺失，并檢測到 PDAC-A 中的兩個cluster和 PDAC-B 中的一個cluster顯示異常 CNV。兩個PDAC-A癌癥cluster-1和cluster-2表現(xiàn)出TM4SF1（cluster-1）或S100A4（cluster-2）的高表達(dá)，而PDAC-B癌癥集群在TM4SF1表達(dá)中高，表明PDAC-A cluster-1和PDAC-B癌癥群的相似性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中識別的TM4SF1和S100A4表達(dá)種群是否代表癌細(xì)胞群，在源自同一患者的組織石蠟切片上對 TM4SF1 和 S100A4 進(jìn)行了雙重免疫熒光染色進(jìn)一步驗(yàn)證了這一現(xiàn)象。
結(jié)果二：PDAC 組織空間轉(zhuǎn)錄組
組織切片及H&E染色揭示了PDAC的四個主要區(qū)域：癌細(xì)胞粘連區(qū)、非惡性導(dǎo)管上皮區(qū)、基質(zhì)區(qū)域和胰腺腺泡區(qū)，其中PDAC-B的患者組織不包含正常的胰腺腺泡區(qū)。然后對樣本進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測序，使用芯片特定位置的barcode對序列進(jìn)行解碼，識別每個轉(zhuǎn)錄本在組織內(nèi)的空間定位。使用 H&E 染色圖像估計每個 ST spot捕獲了大約 20-70 個細(xì)胞、約2400個UMI和大約1000個唯一基因。對所有ST spot中表達(dá)變異程度最高的基因進(jìn)行主成分分析（PCA），根據(jù)主成分對每個ST陣列的spot進(jìn)行聚類后，發(fā)現(xiàn)所生成的cluster與獨(dú)立的組織學(xué)注釋一致，支撐了僅根據(jù)ST基因表達(dá)在一個切片內(nèi)識別不同空間區(qū)域的能力。
結(jié)果三：多模式交叉分析 （MIA）
為了集成 scRNA-seq 和 ST 數(shù)據(jù)集，作者開發(fā)了 多模式交叉分析Multimodal intersection analysis (MIA)。首先劃定細(xì)胞類型特定和組織區(qū)域特定基因集，然后確定它們的重疊程度，相比于隨機(jī)數(shù)值判斷其重疊程度是否顯著富集。在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中識別每個細(xì)胞類型來定義基因集，相比于其他細(xì)胞類型這些基因的表達(dá)該細(xì)胞類型中具有較高的統(tǒng)計學(xué)水平，隨后識別出每個空間區(qū)域的表達(dá)率明顯高于其他區(qū)域的基因。通過超幾何檢驗(yàn)，評估在 scRNA-seq 和 ST 模式中提取的基因集是否顯著重疊，進(jìn)而將空間信息與轉(zhuǎn)錄組信息聯(lián)合起來進(jìn)行其他分析。
結(jié)果四：識別和映射跨組織區(qū)域細(xì)胞亞群
scRNA-seq 最有用的方面之一是它能夠揭示細(xì)胞類型中不同的亞群。因此，作者試圖通過識別細(xì)胞類型中的亞群，然后應(yīng)用 MIA 來查詢整個組織空間的映射來描述細(xì)胞群體內(nèi)部的異質(zhì)性?；趕cRNA-seq發(fā)現(xiàn)兩個腫瘤樣本中大多數(shù)細(xì)胞由KRT19+導(dǎo)管細(xì)胞組成，這是胰腺外分泌系統(tǒng)的兩種主要成分細(xì)胞類型之一。作者總共確定了四個導(dǎo)管細(xì)胞亞群：（1）表達(dá)APOL1和缺氧相關(guān)基因的導(dǎo)管細(xì)胞亞群；（2）表達(dá)TFF1、TFF2和TFF3的終端導(dǎo)管亞群；（3）表達(dá)CRISP3和CFTR的中心亞群；（4）表達(dá)MHC-II類分子和補(bǔ)體通路成分的抗原呈遞導(dǎo)管細(xì)胞。雖然MHC-II類分子主要表現(xiàn)在抗原呈遞細(xì)胞（B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞）的表面，但肝臟、胃腸道和呼吸道的上皮細(xì)胞表達(dá)MHC-II類分子。由于它們存在于腫瘤中，這些抗原呈遞導(dǎo)管細(xì)胞很可能通過促進(jìn)T細(xì)胞活化，在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境內(nèi)的炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮作用。這四種亞群中，第1類和第4類是先前的單細(xì)胞測序沒有報道過的，作者通雙重免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了亞群的存在。
與細(xì)胞類型分析一樣，作者使用每個導(dǎo)管亞群特有的標(biāo)記基因，使用 MIA 確定這些導(dǎo)管亞群在組織切片中的富集情況。作者發(fā)現(xiàn)PDAC-A患者中的所有導(dǎo)管亞群都富集在組織的導(dǎo)管區(qū)域。相比之下，只有缺氧和晚期導(dǎo)管細(xì)胞群在癌癥區(qū)域顯著豐富。這些導(dǎo)管細(xì)胞所展示的轉(zhuǎn)錄表型可能反映來自周圍組織的環(huán)境信號，例如由于含氧量低，癌區(qū)導(dǎo)管細(xì)胞可能表達(dá)缺氧反應(yīng)相關(guān)基因。相比之下，PDAC-B 中的導(dǎo)管亞群都完全富集于導(dǎo)管上皮區(qū)域。
結(jié)果五：整合分析不同癌癥人群PDAC組織
在PDAC-A scRNA-seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了兩個癌細(xì)胞群，這些數(shù)據(jù)在基因和轉(zhuǎn)錄上似乎都截然不同。雖然作者發(fā)現(xiàn)這兩種癌癥種群在相應(yīng)的ST癌癥區(qū)域中都富含，但它們是否與該地區(qū)內(nèi)不同的細(xì)胞類型同位？為了探索PDAC-A患者兩個癌癥種群是否在相同切片區(qū)域共定位的問題，作者對該患者進(jìn)行了額外的組織切片，確保 scRNA-seq 數(shù)據(jù)代表所有 ST 部分：腫瘤切片先分為三個部分，然后每個部分被分在 ST 和 scRNA-seq 之間。通過比較PDAC-A新增的區(qū)域，作者確定了各自PDAC-A樣本區(qū)域特有的基因列表之間的重疊，發(fā)現(xiàn)整個ST數(shù)據(jù)集的癌癥和基質(zhì)區(qū)域之間有顯著重疊。對于每個組織部分中癌癥豐富的區(qū)域，使用分層聚類進(jìn)一步將癌癥豐富的區(qū)域劃分為轉(zhuǎn)錄組相關(guān)的分區(qū)。在定義了每個子區(qū)域特有的基因集后，再次應(yīng)用 MIA 映射方法來研究與子區(qū)域相關(guān)的基因集、每個細(xì)胞類型定義的基因集和 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中的子群之間的重疊，進(jìn)一步定義了細(xì)胞類型/亞群與組織空間之間的關(guān)聯(lián)性。
結(jié)果六：解析腫瘤微環(huán)境下的細(xì)胞狀態(tài)關(guān)系
最近對癌細(xì)胞scRNA-seq數(shù)據(jù)的研究表明，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、頭頸癌等多種癌癥類型中，細(xì)胞狀態(tài)是獨(dú)一無二的。由于ST提供空間信息，是否可以繪制癌細(xì)胞狀態(tài)到不同的空間組織區(qū)域，并描述它們與其他細(xì)胞類型的相互作用。為此，作者生成了第三個PDAC scRNA-seq數(shù)據(jù)集并定義PDAC癌細(xì)胞中的三個基因表達(dá)模塊。根據(jù)每個模塊的基因，注釋這些作為缺氧反應(yīng)，氧化磷酸化和應(yīng)激響應(yīng)模塊。作者發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞和T/NK細(xì)胞在應(yīng)激反應(yīng)模塊區(qū)域大量富集。綜合分析TCGA PDAC數(shù)據(jù)，結(jié)果表明涉及炎癥性成纖維細(xì)胞和表達(dá)應(yīng)激基因模塊的癌細(xì)胞之間的關(guān)系，并驗(yàn)證了MIA方法對于生成細(xì)胞群與空間受限結(jié)構(gòu)的關(guān)系的效能。
小結(jié)：
作者對于單細(xì)胞測序和空間轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行了整合分析，開發(fā)了MIA分析方法，系統(tǒng)揭示了胰腺導(dǎo)管腺癌的空間組織結(jié)構(gòu)，為我們提供了良好的整合分析思路。
