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癌癥治療中的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)是檢測(cè)可能具有耐藥性的稀有細(xì)胞亞群。隨著高分辨率微陣列和測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，增加了我們對(duì)卵巢上皮性腫瘤標(biāo)志物的了解。今天給大家分享的這篇文獻(xiàn)是發(fā)表于Oncogene（IF: 9.867）上的關(guān)于卵巢上皮性腫瘤的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組結(jié)合常規(guī)轉(zhuǎn)錄組的一項(xiàng)研究，提供了不可多得的卵巢上皮性腫瘤的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，同時(shí)我們也可以一起來學(xué)習(xí)一下這篇文章的研究思路。
單細(xì)胞RNA-seq識(shí)別卵巢上皮性腫瘤復(fù)發(fā)的起因
研究背景
卵巢上皮性腫瘤（EOC）是所有婦科癌癥中最致命的癌癥類型。由于早期無癥狀，80%以上的EOC患者晚期(III或IV期)才被確診并伴有腹膜轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。EOC對(duì)化療藥物高度敏感，但是復(fù)發(fā)率也高。在大多數(shù)晚期EOC患者中，中位無復(fù)發(fā)間隔期（RFI）為16-22個(gè)月，5年生存率<30%。在幾乎所有癌癥類型中，轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。從原發(fā)性腫瘤中逃逸出來的播散腫瘤細(xì)胞（DTC）和播散腫瘤細(xì)胞群被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移的起因，此外，腫瘤轉(zhuǎn)移還與腫瘤微環(huán)境（TME）以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)。因此研究人員提出識(shí)別出EOC中這一關(guān)鍵的腫瘤細(xì)胞亞群可能為預(yù)防復(fù)發(fā)的治療干預(yù)提供新的靶點(diǎn)。
結(jié)果
1. 卵巢上皮性腫瘤單細(xì)胞圖譜
作者首先對(duì)8個(gè)卵巢上皮性腫瘤（EOC）患者樣本的13369個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，其中包括四個(gè)原發(fā)腫瘤（Ps）、兩個(gè)未經(jīng)治療的腹膜轉(zhuǎn)移腫瘤（Ms）和兩個(gè)復(fù)發(fā)腫瘤（Rs）（圖1a）。通過無監(jiān)督共識(shí)聚類共鑒定出14個(gè)不同的細(xì)胞類群，其中有8個(gè)細(xì)胞群中的細(xì)胞主要來源于同一個(gè)樣本（圖1b），且這8個(gè)細(xì)胞群都是上皮起源（EPCAM）。其他6個(gè)細(xì)胞群由來自不同患者的細(xì)胞組成。如圖1c所示，通過對(duì)已知標(biāo)記基因的分析可以確定這6個(gè)細(xì)胞群分別為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF，包含兩個(gè)群）、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和正常卵巢組織細(xì)胞。
目前主要有兩種方法鑒定上皮腫瘤細(xì)胞：一種是基于拷貝數(shù)變化和點(diǎn)突變，另一種則是基于上皮細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)情況。從圖1c中可以觀察到上皮細(xì)胞標(biāo)記基因和其他細(xì)胞類型標(biāo)記基因的表達(dá)顯著不同，因此作者認(rèn)為上皮起源的8個(gè)細(xì)胞群是腫瘤細(xì)胞，其他細(xì)胞群則被歸類為基質(zhì)細(xì)胞，即共鑒定出了10364個(gè)腫瘤細(xì)胞和3005個(gè)基質(zhì)細(xì)胞（圖1d）。作者還注意到，腫瘤細(xì)胞主要根據(jù)其樣本來源進(jìn)行聚集，而基質(zhì)細(xì)胞則主要根據(jù)其特定的細(xì)胞類型進(jìn)行聚集，每個(gè)細(xì)胞群中包含來自不同樣本的細(xì)胞，這一現(xiàn)象說明癌癥患者的個(gè)體間異質(zhì)性非常顯著。
對(duì)基質(zhì)細(xì)胞的進(jìn)一步聚類分析顯示，根據(jù)其基因表達(dá)差異，THY1+ CAF有兩個(gè)亞群，而CD2+ T細(xì)胞可根據(jù)T細(xì)胞表達(dá)狀態(tài)分為細(xì)胞毒性T細(xì)胞和耗竭性T細(xì)胞。如圖1e，每種細(xì)胞類型的比例在不同的腫瘤類型中差異很大。例如，在未經(jīng)治療的腹膜轉(zhuǎn)移腫瘤中，腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的比例遠(yuǎn)高于其他腫瘤類型，而在所有腫瘤類型中，復(fù)發(fā)腫瘤中的腫瘤細(xì)胞比例最高。
2. 對(duì)轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行細(xì)胞軌跡分析以確定起始細(xì)胞
為了揭示兩種未經(jīng)治療的腹膜轉(zhuǎn)移瘤（M1、M2）和兩種復(fù)發(fā)瘤（R1、R2）中腫瘤細(xì)胞的發(fā)育順序，作者使用基于不同原理的兩種無監(jiān)督算法進(jìn)行了獨(dú)立的細(xì)胞軌跡分析。第一種算法是“RNA速度”分析，它可以通過區(qū)分scRNA-seq數(shù)據(jù)中未剪切的和成熟的mRNA的相對(duì)豐度，以預(yù)測(cè)單個(gè)細(xì)胞的發(fā)育（圖2a-d）。第二種算法是Monocle擬時(shí)間分析，它可以定量測(cè)量單細(xì)胞在生物過程中的進(jìn)展，尤其是增殖和分化，通過發(fā)育調(diào)控基因表達(dá)的變化確定細(xì)胞命運(yùn)（圖2e-h）。每個(gè)轉(zhuǎn)移性腫瘤的細(xì)胞根據(jù)擬時(shí)間軌跡排列（圖2i–l，頂部軌跡），擬時(shí)間起始分支上的細(xì)胞則被定義為所有后續(xù)細(xì)胞的起始細(xì)胞亞群。為了比較這兩種算法的結(jié)果，作者還使用RNA速率識(shí)別的細(xì)胞群的名稱沿?cái)M時(shí)間軌跡給細(xì)胞著色（圖2i–l，中間軌跡）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)腫瘤細(xì)胞群的預(yù)測(cè)偽時(shí)間順序與其估計(jì)的細(xì)胞狀態(tài)速度一致。綜合上述結(jié)果，兩種算法起始位置中出現(xiàn)的重疊細(xì)胞被確定為每個(gè)轉(zhuǎn)移性EOC腫瘤中起始細(xì)胞（圖2i–l，底部軌跡，橢圓中的紅色細(xì)胞群）。
作者又對(duì)保守標(biāo)記基因進(jìn)行了功能分析，結(jié)果表明，未經(jīng)治療的腹膜轉(zhuǎn)移瘤（M1、M2）中的起始細(xì)胞主要與免疫反應(yīng)有關(guān)（如CD81、HLA-A、HLA-DRB1、XBP1、CFB、C3），復(fù)發(fā)腫瘤（R1、R2）中的起始細(xì)胞則主要與細(xì)胞周期有關(guān)（如MKI67、CKS2、ANLN、CDC20、CDCA8、CENPF）（圖3a）。在這兩種轉(zhuǎn)移性腫瘤之間并沒有發(fā)現(xiàn)共同的轉(zhuǎn)錄特征，但它們中的免疫細(xì)胞比例都相當(dāng)高，而在任何復(fù)發(fā)腫瘤樣本中幾乎沒有觀察到免疫細(xì)胞（圖1e）。作者在進(jìn)一步對(duì)腹膜轉(zhuǎn)移腫瘤中免疫應(yīng)答基因的研究中發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間存在受體-配體相互作用，包括T細(xì)胞通過淋巴毒素和腫瘤壞死因子（TNF）介導(dǎo)的細(xì)胞毒性以及腫瘤細(xì)胞通過趨化因子介導(dǎo)的T細(xì)胞募集（圖3b）。此外，在兩個(gè)復(fù)發(fā)性腫瘤樣本中，G1/S或G2/M期細(xì)胞在起始細(xì)胞群中富集，但在腹膜轉(zhuǎn)移腫瘤中少見且分散存在（圖3c）。
3. 追蹤原發(fā)性腫瘤中的轉(zhuǎn)移起始細(xì)胞
為了追蹤原發(fā)性腫瘤中轉(zhuǎn)移起始細(xì)胞的來源，作者首先分析了每個(gè)原發(fā)性EOC樣本中腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)情況。通過無監(jiān)督聚類，從四種原發(fā)性腫瘤中鑒定出了23個(gè)特征基因。為了對(duì)這些特征基因進(jìn)行功能注釋，作者對(duì)前100個(gè)共表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，一共定義了7種類型基因表達(dá)模式（如圖3d）。然后作者又重新定義了四種原發(fā)性腫瘤中保守的轉(zhuǎn)移起始特征基因，繪制了轉(zhuǎn)移起始基因集或復(fù)發(fā)起始基因集（圖3f）的單細(xì)胞表達(dá)評(píng)分（圖3e-f），發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)起始特征基因在“cycling”或“stress”類型中富集（圖3f）。上述結(jié)果表明，任何類型的腫瘤細(xì)胞都可以在化療前進(jìn)行轉(zhuǎn)移，但是只有特定的腫瘤細(xì)胞亞群可以在化療后存活，從而引發(fā)腫瘤復(fù)發(fā)。
通過之前的分析，復(fù)發(fā)腫瘤中的起始細(xì)胞被證明是cycling細(xì)胞。然而，引發(fā)復(fù)發(fā)的DTCs不太可能起源于原發(fā)腫瘤的cycling亞群，因?yàn)樵l(fā)腫瘤中的cycling細(xì)胞是化療的靶點(diǎn)，且其生存幾率較低。因此作者猜測(cè)可能是non-cycling 或者 low-cycling的DTCs在藥物治療后存活下來，并獲得進(jìn)入細(xì)胞周期的能力，從而引起了腫瘤的復(fù)發(fā)。為了揭示cycling類型復(fù)發(fā)起始細(xì)胞的基因表達(dá)情況，作者將復(fù)發(fā)腫瘤的起始細(xì)胞與原發(fā)腫瘤的cycling細(xì)胞進(jìn)行了比較。在復(fù)發(fā)腫瘤的起始細(xì)胞中鑒定了45個(gè)基因（圖4a），這些基因主要與色素顆粒、應(yīng)激反應(yīng)和蛋白質(zhì)折疊功能有關(guān)。圖4b的t-SNE圖譜顯示了這45個(gè)標(biāo)記基因在四個(gè)原發(fā)性EOC腫瘤表達(dá)水平。
4. CYR61在復(fù)發(fā)起始因子中高度表達(dá)，并與耐藥性相關(guān)
作者根據(jù)耐藥性特征以及Puram等人報(bào)道的腫瘤內(nèi)部分EMT（p-EMT）特征，評(píng)估了“stress”亞群中腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)相關(guān)特性。與來自其他腫瘤內(nèi)基因表達(dá)模式的腫瘤細(xì)胞亞群相比，“stress”亞群具有相對(duì)較高的耐藥性得分（圖4c）。因此EOC的復(fù)發(fā)始作俑者很可能是來自原發(fā)腫瘤的“stress”亞群，這可能是防止EOC復(fù)發(fā)的一個(gè)重要治療靶點(diǎn)。于是作者分別從四種原發(fā)腫瘤的“stress”亞群中鑒定出12、7、13和22個(gè)標(biāo)記基因；鑒定標(biāo)準(zhǔn)有兩個(gè)，一個(gè)是在“stress”亞群中超過30%的細(xì)胞中表達(dá)，第二個(gè)則是在其他亞群中無表達(dá)或低表達(dá)。其中CYR61被確定為四個(gè)EOC患者樣本中“stress”亞群的常見生物標(biāo)記物（圖4d-e）。
CYR61編碼的是一種分泌的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞粘附、遷移、增殖、凋亡、衰老和分化，CYR61表達(dá)已被證明在多種癌癥中與耐藥性相關(guān)。作者通過基因網(wǎng)絡(luò)互作分析進(jìn)一步明確了幾個(gè)耐藥基因信號(hào)通路和CYR61表達(dá)之間的直接和間接聯(lián)系（圖4f）。CYR61染色結(jié)果顯示，與原發(fā)腫瘤相比，復(fù)發(fā)腫瘤中的CYR61+細(xì)胞百分比顯著升高（>80%）（圖4g）。CYR61+細(xì)胞的高百分比與腫瘤細(xì)胞的耐藥性增加呈現(xiàn)正相關(guān)性（圖4h）。此外，作者還進(jìn)行了GSEA分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYR61+細(xì)胞亞群和復(fù)發(fā)起始亞群都表現(xiàn)出20種耐藥相關(guān)途徑的顯著上調(diào)（圖4i）。
5. RGS5+CAF亞群促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移
作者為了探究腫瘤組織中CYR61的總體表達(dá)水平，進(jìn)一步分析了8個(gè)EOC樣本的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)，鑒定出了12個(gè)應(yīng)激相關(guān)基因（包括CYR61），并觀察到許多與CAF相關(guān)的ECM編碼基因（如COL1A1、COL1A2、COL3A1、FN1）高表達(dá)（圖5a）。根據(jù)不同的基因表達(dá)情況，作者將EOC中的CAF細(xì)分為兩個(gè)亞群。富集分析顯示，CAF2的標(biāo)記基因在ECM和細(xì)胞粘附功能中富集，而CAF1的標(biāo)記基因在響應(yīng)刺激、血管生成和抗凋亡等功能中富集（圖5b）。因此，作者認(rèn)為CAF，尤其是CAF1，是原位腫瘤生長和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散關(guān)鍵因素（圖5c）。
相關(guān)性分析顯示，整個(gè)腫瘤組織的EMT評(píng)分與CAF1與腫瘤細(xì)胞的比率高度正相關(guān)，同時(shí)純腫瘤細(xì)胞的EMT評(píng)分與CAF1的數(shù)量也顯著相關(guān)（圖5d-g）。作者進(jìn)一步探索了8個(gè)EOC樣本中最具代表性的CAF1生物標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)候選基因RGS5和COL4A1在CAF1中高表達(dá)，通過比較這兩個(gè)基因在CAF群中的表達(dá)特異性，最后RGS5被確定為CAF1中特異性的生物標(biāo)記物（圖5h-j）。
6. CYR61/RGS5表達(dá)水平反映了EOC的RFI
在確定了兩個(gè)腫瘤內(nèi)細(xì)胞亞群的生物標(biāo)記物后，作者首先在8個(gè)EOC樣本中進(jìn)行CYR61和RGS5的IHC聯(lián)合染色，以驗(yàn)證樣本制備和scRNA-seq數(shù)據(jù)分析的可靠性（圖6a）。很明顯，IHC結(jié)果中CYR61腫瘤細(xì)胞和RGS5+CAF的百分比與scRNA-seq結(jié)果中的百分比一致，并驗(yàn)證了CAF1通過腫瘤細(xì)胞TME相互作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT。對(duì)比EOC的組織學(xué)亞型在EOC RFI分析的分類能力，說明了從scRNAseq中發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)記物在EOC的所有組織學(xué)亞型中具有很強(qiáng)的復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)潛力（圖6d-f）。
小結(jié)
EOC對(duì)化療很敏感，但大多數(shù)患者最終會(huì)復(fù)發(fā)并產(chǎn)生耐藥性。認(rèn)識(shí)原發(fā)性EOC腫瘤中的復(fù)發(fā)起始細(xì)胞對(duì)指導(dǎo)臨床實(shí)踐具有重要意義，作者通過采用scRNA-seq技術(shù)結(jié)合常規(guī)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析克服了腫瘤個(gè)體之間異質(zhì)性的影響，最后確定了在不同的EOC亞型中，復(fù)發(fā)通常是由特異性表達(dá)CYR61的耐藥原發(fā)腫瘤細(xì)胞亞群引起的。此外，還發(fā)現(xiàn)RGS5+CAF亞群對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。
