腫瘤中性粒細胞鐵死亡導致癌癥免疫抑制

本11月16日Nature雜志發(fā)表了一篇關于鐵死亡的文章“Ferroptosis of tumour neutrophils causes immune suppression in cancer”（IF: 69.504）。文章主要發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的PMN-MDSCs會發(fā)生自發(fā)性鐵死亡。通過遺傳學方法和藥物抑制鐵死亡，可消除PMN-MDSCs的抑制活性，減少腫瘤進展，并與免疫檢查點阻斷劑協(xié)同抑制腫瘤生長。

背景

病理激活的中性粒細胞稱為髓源性抑制細胞（PMN-MDSCs），它具有獨特的轉錄、蛋白質組學和代謝特征，且具有免疫抑制作用。在腫瘤中與不良預后和免疫治療抵抗相關。最近的研究顯示PMN-MDSCs對鐵死亡具有更高的敏感性。

有幾種導致鐵死亡的因素，GPX4/GSH機制在鐵死亡中發(fā)揮重要作用。常用的鐵死亡誘導劑分別靶向GPX4和胱氨酸-谷氨酸逆向轉運體系。但是鐵死亡誘導劑在體外實驗中對腫瘤細胞有顯著的殺傷力，在動物實驗中卻沒有明顯效果。因此鐵死亡對于免疫細胞的影響依然有待發(fā)現(xiàn)。

主要結果

• 腫瘤PMN-MDSCs易發(fā)生鐵死亡

對人類腫瘤和小鼠腫瘤PMN-MDSCs的全轉錄分析顯示，鐵死亡調節(jié)相關基因表達上調（圖1a,b）。作者將人類PMN-MDSC RNA-seq數(shù)據(jù)表達差異最顯著的8個鐵死亡相關基因作為基因signature，并將其應用于先前報道的非小細胞肺癌(NSCLC)患者的scRNA-seq數(shù)據(jù)集。在腫瘤PMN中發(fā)現(xiàn)鐵死亡signature的表達高于外周血PMN，以及其他骨髓細胞和腫瘤T細胞（圖1c,d）。作者從EL-4淋巴瘤、CT26結腸癌、Lewis肺癌(LLC)等可移植小鼠模型的骨髓(BM)、脾臟和腫瘤中分離出的PMN-MDSCs，以及轉基因KrasG12DTrp53氧化磷脂酰乙醇胺Pdx1-cre (KPC)小鼠的原發(fā)胰腺癌中分離出的PMN-MDSCs中，對鐵死亡相關基因進行了深入分析。與從骨髓和脾臟分離的PMN-MDSCs相比，腫瘤PMN-MDSCs顯示出鐵死亡相關基因的顯著上調(圖2)。

鐵死亡的特征是鐵死亡相關的脂質信號，包括含有花生四烯酸的氧化磷脂酰乙醇胺(AA-PEox)。作者在不同的腫瘤模型中使用質譜(MS)測量了PMN中的PEox。在腫瘤PMN-MDSCs中觀察到AA-PEox的積累，但在從脾臟和BM分離的細胞中并沒有觀察到AA-PEox的積累(圖3a)。為了評估不同組織中PMN-MDSCs對鐵死亡的內在脆弱性，這些細胞被鐵死亡觸發(fā)因子RSL3處理。不同腫瘤模型的腫瘤PMN-MDSCs對RSL3的敏感性明顯高于BM和脾臟PMN-MDSCs(圖3b)。為了進一步闡明鐵死亡對PMN-MDSC死亡的貢獻，從EL-4 TB小鼠的脾臟和腫瘤中分離細胞，然后在凋亡抑制劑(z-VAD-FMK (zVAD))、ferroptosis (鐵他汀-1)或necroptosis (壞死他汀-1)的存在下培養(yǎng)24小時。zVAD顯著提高了脾臟PMN-MDSCs的存活率，證實了凋亡對PMN-MDSC細胞死亡的貢獻，而ferroptosis或necroptosis不影響細胞存活。相比之下，腫瘤PMN-MDSCs的生存能力不僅受到zVAD的改善，而且還受到鐵抑素-1的改善，這表明鐵死亡有助于腫瘤PMN-MDSCs的死亡(圖3c)。

為了進一步確定PMN-MDSCs在不同組織中經歷的細胞死亡類型，作者對PMN-MDSCs進行了整體氧化還原脂質組學分析。沒有發(fā)現(xiàn)從幼鼠和結核病小鼠的骨髓分離的細胞之間基于脂質的細胞死亡信號的含量有任何變化。在從腫瘤中分離的PMN-MDSCs中，與鐵死亡激活相關的氧合PE是主要成分，其含量顯著高于從骨髓和脾中檢測到的PMN-MDSCs。腫瘤PMN-MDSCs中，與壞死性和焦性細胞死亡途徑相關的脂源性信號水平沒有升高。腫瘤PMN-MDSCs與骨髓和脾臟PMN-MDSCs的凋亡氧化脂質信號含量無差異(圖3d)。這些數(shù)據(jù)表明，鐵死亡途徑是腫瘤PMN-MDSCs的一種主要的細胞死亡程序。

CD71是鐵死亡的已知細胞標志物，作者證實了用RSL3治療的BM PMN中CD71表達上調，但在凋亡或壞死誘導物處理中沒有(圖4c)。腫瘤PMN-MDSCs，CD71的表達顯著高于其在脾中的對應物(圖4d)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，與骨髓和脾PMN-MDSCs相比，腫瘤PMN-MDSCs經歷了鐵性死亡。

• 腫瘤PMN-MDSCs的抑制功能

作者研究了鐵死亡是否賦予非免疫抑制PMN以抑制功能。用RSL3或細胞凋亡誘導劑staurosporine處理無瘤小鼠的BM PMN，然后去除藥物并用于實驗。發(fā)現(xiàn)經RSL3處理的PMN在夜間孵育后存活的數(shù)量顯著減少，這表明化合物引起了預期的細胞死亡（圖4e）。RSL3處理后，PMN獲得了有效的抑制活性，表現(xiàn)為PMEL CD8+ T細胞的增殖下降，在同源肽存在時表達針對黑色素瘤gp100衍生肽的T細胞受體(圖5a)。Alox12/15的缺失消除了RSL3誘導的培養(yǎng)中PMN-MDSC數(shù)量的減少（圖4g）。RSL3處理的PMN上清液對PMEL脾臟細胞有較強的抑制作用。此活動在具有ALOX12/15缺失的PMN中消失（圖5b）。

為了驗證鐵死亡在PMN介導的T細胞抑制中的作用，使用了鐵死亡誘導劑IKE和鐵死亡的藥物抑制劑Liproxstatin-1。在Liproxstatin-1存在或不存在的情況下，用IKE處理BM PMN，上清液加入同源肽刺激的PMEL細胞。在40μM時，IKE對PMN活性的影響不大(圖4h)，但仍抑制T細胞的增殖。這種作用被Liproxstatin-1消除（圖5c）。在較高濃度(50μM)下，IKE減少了PMN的數(shù)量(圖4i)，這一點被Liproxstatin-1逆轉。凋亡抑制劑zVAD略微降低了IKE對中性粒細胞存活的影響，提示IKE也可能促進了PMN的凋亡。IKE引起PMN強烈誘導抑制活性，這不受zVAD的影響，但基本上可被Liproxstatin-1逆轉(圖5d)。接下來，從EL-4TB小鼠的腫瘤中分離出PMN-MDSCs，并用凋亡、鐵死亡和壞死性死亡的抑制劑治療這些細胞。在這些PMN-MDSCs存在下，檢測抗原特異性T細胞的增殖。DMSO處理的對照PMN-MDSCs顯示出強烈的抑制活性，這種抑制活性不受抑制細胞凋亡或壞死性死亡的影響，但被Liproxstatin-1所消除（圖5e）。腫瘤微環(huán)境(TME)中的條件是否會導致PMN-MDSCs鐵死亡介導的抑制。低氧可誘導中性粒細胞抑制活性，這種抑制作用可被鐵死亡抑制作用所消除。在常氧條件下，骨髓中性粒細胞不受抑制，Liproxstatin-1對其無影響(圖4j)。

為了測試鐵死亡對體內PMN-MDSCs抑制功能的影響，建立了EL-4皮下腫瘤(S.C.)。在ALOX12/15flcre?和ALOX12/15flcre+小鼠中。Alox12/15flcre+小鼠的PMN-MDSCs的腫瘤上清液顯著降低了抑制活性。Acsl4的缺失大大降低了腫瘤PMN-MDSCs上清液的抑制活性，但不影響EL4結核病小鼠脾PMN-MDSCs的抑制活性(圖5m)。這些結果表明，鐵死亡對腫瘤PMN-MDSCs的免疫抑制活性有重要作用，但對脾臟PMN-MDSCs的免疫抑制活性無影響。

為了驗證鐵死亡在PMN-MDSC介導的抑制中的作用，作者從頭頸癌和子宮癌患者的腫瘤組織中分離出PMN-MDSC，并在Liproxstatin-1存在的情況下測試了它們對CD3/CD28激活的T細胞的抑制活性。經Liproxstatin-1治療后，PMN-MDSC抑制活性顯著降低(圖5h)。此外，經IKE處理的PMN可有效抑制CD3/CD28誘導的T細胞增殖；這種作用可被Liproxstatin-1取消(圖5i)。因此，在人類細胞中也觀察到了鐵死亡介導的PMN向PMN-MDSCs的轉化。

• 腫瘤PMN-MDSCs中鐵下垂的誘導

為了評估鐵死亡誘導過程中中性粒細胞的變化，對RSL3或星形孢子素處理4h的骨髓中性粒細胞進行了全轉錄RNA-seq分析。通過上調鐵死亡相關基因的表達證實了RSL3誘導的死亡。RSL3處理的中性粒細胞有一個獨特的轉錄圖譜，其特征是參與氧化應激、泛素化和各種熱休克蛋白的多個基因上調。與PMN-MDSC介導的抑制相關的Arg1和NOS2的表達沒有變化，但RSL3處理PMN導致參與前列腺素E2(PGE₂)生物合成的基因顯著上調（圖6）。

之后作者評估了Alox12/15缺失對腫瘤PMN-MDSC基因表達譜的影響，從Alox12/15flcre?和Alox12/15flcre+小鼠腫瘤中分離的PMN-MDSC進行了RNA-seq，并使用PMN-MDSC signature。GSEA分析發(fā)現(xiàn)，在Alox12/15敲除后，PMN-MDSCs中特異抑制的基因被逆轉(圖7a)?；蚣患治霰砻?，在PMN-MDSCs中Alox12/15的缺失導致與補體激活、中性粒細胞介導的免疫、單核細胞趨化以及抗原處理和提呈相關的基因上調(圖7b,c)。因此，阻斷PMN-MDSCs中鐵死亡導致與經典的PMN激活相關的基因上調，表明這些細胞的極化從病理激活的PMN-MDSCs轉變?yōu)榻浀涞腜MN。野生型和ALOX12/15flcre+小鼠腫瘤PMN-MDSCs的代謝組差異表達的代謝物進行的獨創(chuàng)性途徑分析(IPA)顯示，PMN-MDSCs中鐵死亡的阻斷與蛋白質合成和信號轉導途徑的上調有關(圖7d)。

PGE₂與PMN-MDSC抑制活性直接相關。作者評估了存在鐵死亡缺陷的腫瘤PMN-MDSCs產生PGE₂的能力（Alox12/15 ^flcre⁺和Acsl4^flcre⁺小鼠模型）。在這兩個模型中，主要促鐵基因的缺失導致腫瘤PMN-MDSCs釋放的PGE₂大幅減少(圖8a)。在存在或不存在PGE₂合成抑制劑的情況下，用RSL3或IKE處理骨髓PMN?；蛘?，在PMN-脾臟細胞共培養(yǎng)中加入PGE₂受體的阻斷劑EP2和EP4，來阻止脾臟細胞中的PGE₂信號。COX抑制劑沒有改變PMN計數(shù)(圖8b)，但它們顯著減少了鐵死亡誘導的T細胞抑制。Coxi和EP2/Ep4阻斷劑都不能完全阻斷鐵死亡誘導的抑制作用(圖8c,d)，這表明多條途徑可能參與了PMN-MDSC鐵性下垂介導的抑制的調節(jié)。

AA-PEOX的積聚是鐵死亡的一個特征。先前證實了脂肪酸轉運蛋白FATP2在PMN-MDSCs中上調。為了測試FATP2是否參與了腫瘤PMN-MDSCs中鐵死亡的誘導，使用了PMN和MON靶向缺失SLc27a2(編碼FATP2)的小鼠模型。在FATP2缺陷的PMN-MDSCs中，鐵死亡相關基因的表達以及氧化的AA-PEox水平(圖8e)顯著降低。表明了FATP2參與了PMN-MDSCs中鐵死亡的調節(jié)。小鼠的PMN-MDSCs中游離AA的含量沒有變化，但PGE2的含量顯著減少(圖8f)。接著，評估了FATP2是否可以調節(jié)中性粒細胞鐵性死亡的誘導。在SLc27a2^flcre^?和slc27a2^flcre⁺小鼠的骨髓PMN中檢測了不同的PEOX(作為鐵死亡的指標)。RSL3誘導了PMN中PEox的積聚。然而，在缺乏FATP2的細胞中沒有這種效應(圖8g)。因此，F(xiàn)ATP2的上調可能在中性粒細胞鐵性下垂的誘導中起關鍵作用。

接下來，分析了氧化性磷脂對T細胞增殖的作用，氧化磷脂是鐵死亡的主要產物。作者使用了四種合成的磷脂和它們的氧化對應物。氧化型PE和PC在5μM濃度下對小鼠T細胞增殖有明顯的抑制作用，而非氧化型PE和PC則無此作用，氧化的PE在較高濃度(10μM)時導致T細胞增殖顯著減少(圖8h)。從RSL3處理的小鼠骨髓PMN中提取的脂類可顯著抑制T細胞的增殖(圖8i)。這些結果表明，鐵死亡誘導的氧化脂質在T細胞抑制中起直接作用。

在PMN-MDSCs中，髓過氧化物酶(MPO)在脂質氧化中起關鍵作用。我們發(fā)現(xiàn)，與Mpo-KO小鼠腫瘤PMN-MDSCs中檢測到的相比，從LLC WT小鼠分離的腫瘤PMN-MDSCs中檢測到的PE和含AA以及含氧AA的溶血磷脂酰乙胺的含量顯著更高(圖9c)。并且作者證明它們的形成被liproxstatin-1抑制(圖9d)。這些結果表明，在PMN-MDSCs中不僅存在游離PGE₂，還存在其酯化成PE和溶血磷脂酰乙醇胺的形式。這些數(shù)據(jù)支持鐵死亡介導的免疫抑制與細胞死亡不同的概念，可以在細胞死于鐵死亡之前觀察到。

接下來，研究了PMN-MDSCs的鐵死亡可能會影響TME中其他細胞的功能活動，特別是腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)。在兩種小鼠模型中（MPO缺失的小鼠和ALOX12/15flcre+小鼠），鐵死亡抑制僅限于PMN-MDSCs。在EL-4腫瘤中，在兩種小鼠模型中抑制PMN-MDSCs中的鐵死亡導致TAMS中FALIS和PGE2的顯著下降(圖10d,e)。在MPO缺失和ALOX12/15flcre+小鼠中，TAMS的抑制活性顯著降低(圖10f)。這些結果提示，PMN-MDSCs的鐵性死亡可能影響TAMS的鐵性下垂的誘導和抑制活性。

• 鐵死亡抑制抑制腫瘤生長

為了確定藥物抑制鐵死亡對腫瘤生長的影響，作者在sc植入的EL-4和LLC TB小鼠中使用了耐受劑量的liproxstatin-1。liproxstatin-1對腫瘤的生長沒有顯著影響。然而，在這兩種腫瘤模型中，liproxstatin -1治療消除了腫瘤PMN-MDSCs的抑制活性。這與這些細胞產生的PGE₂顯著減少有關（圖11a-c）。為了評估liproxstatin-1的治療潛力，在小鼠的腫瘤的較早時間開始治療，并持續(xù)14天。在這兩個模型中，抑制鐵死亡可顯著降低腫瘤生長(圖12a)。

在免疫缺陷的Rag2^?/?Il2rg^?/?雙敲除CT26 TB小鼠中，liproxstatin-1的治療效果被消除(圖12b)，表明該治療具有強烈的免疫系統(tǒng)依賴性。在接受Liproxstatin-1治療的CT26腫瘤中，PMN-MDSCs和T細胞的數(shù)量高于對照組(圖11d)。在這些腫瘤模型中，Liproxstatin-1增強了PD-1抗體免疫檢查點阻斷的抗腫瘤作用(圖12c)。

為了進一步研究鐵死亡對腫瘤生長的影響，作者在免疫活性結核小鼠中誘導了鐵死亡。IKE治療略微增加了CT26腫瘤的生長(圖12d)。這表明，在免疫活性宿主中，誘導鐵死亡并不能阻止腫瘤的生長。在另一組實驗中，CT26結核病小鼠接受了帶有和不帶有IKE的PD-1抗體(圖12d)。即使同時服用抗PD-1抗體，IKE也促進了腫瘤的生長。

為了更好地了解鐵死亡抑制在PD-1反應中的作用，使用KPC小鼠晚期原發(fā)腫瘤的PD-1抗性胰腺腫瘤細胞克隆。鐵死亡抑制與抗PD-1有協(xié)同作用，可使50%的移植胰腺腫瘤消退(P=0.0325)。在10只小鼠中只有1只觀察到快速進展(>200%的體積變化)，而在10只對照組小鼠中有8只觀察到快速進展(P=0.006)(圖12e)。這些結果表明，即使在免疫治療耐藥的腫瘤中，Liproxstatin-1也可以增強PD1抗體的作用。

在淋巴結中，Liproxstatin-1治療增加了CD8⁺T細胞的比例以及Ki67⁺CD8⁺T細胞的增殖(圖13c)。效應性記憶T細胞顯著增加，na?ve T細胞、中央記憶T細胞和調節(jié)性T細胞比例下降。在腫瘤中，Liproxstatin-1治療導致駐留記憶、中央記憶和效應CD8+T細胞以及自然殺傷細胞顯著增加(圖13d)。為了更好地表征腫瘤中的T細胞，用Liproxstatin-1治療CT26腫瘤小鼠，并進行scRNA-seq。在用Liproxstatin-1治療的小鼠腫瘤中，T細胞激活（圖14）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，鐵死亡抑制劑治療的腫瘤的TME中有一個活躍的T細胞群。

之后作者評估了鐵死亡基因signature與臨床結果的相關性。用RSL3治療健康捐獻者的外周血中性粒細胞，導致這些基因顯著上調(圖15a)，證實了它們與鐵死亡有關。RSL3還誘導PGE2的產量大幅增加(圖15b)。從非小細胞肺癌腫瘤分離的PMN-MDSCs的PGE₂產量明顯高于外周血PMN-MDSCs(圖15c)。

接著作者使用TCGA胰腺癌數(shù)據(jù)集和一套獨立的肺癌數(shù)據(jù)分析了外周血PMN-MDSCs中鐵死亡signature與PMN-MDSC基因signature的相關性。雖然PMN-MDSC signature與鐵死亡signature沒有重疊的基因，但PMN-MDSC與鐵死亡signature呈正相關(圖12f，h)，并在鐵死亡基因表達較低的患者組提高了存活率(圖12g)。鐵死亡signature與較差的存活率有關(圖12i)。在接受免疫治療的患者中，發(fā)現(xiàn)鐵死亡與患者存活率之間存在更強的反向關聯(lián)(圖12i)。

總結

本文作者發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的PMN-MDSCs會發(fā)生因鐵死亡，這使得它們更具免疫抑制作用。雖然減少了PMN-MDSCs的存在，但鐵死亡誘導含氧脂質的釋放，并限制了人和小鼠T細胞的活性。有幾個因素使腫瘤PMN-MDSCs對鐵死亡的誘導特別敏感。其中一個因素是低氧介導的腫瘤PMN-MDSCs中GPX4的下調，促進PEox的積累以驅動鐵死亡。還確定了AA轉運體FATP2在腫瘤PMN-MDSCs中鐵死亡的調節(jié)作用。腫瘤PMN-MDSC傾向于通過FATP2轉運AA，這可能是PMN-MDSC對鐵死亡的敏感性高于TME中其他髓系細胞類型的原因。在具有免疫能力的小鼠中，對鐵死亡的遺傳學和藥物抑制可以取消PMN-MDSCs的抑制活性，減緩腫瘤的進展，并與免疫檢查點阻斷協(xié)同作用以抑制腫瘤的生長。相比之下，在免疫能力強的小鼠中誘導鐵死亡會促進腫瘤的生長。因此，鐵死亡是PMN-MDSCs在腫瘤微環(huán)境中的一種獨特的、有針對性的免疫抑制機制，可以通過藥物調節(jié)來限制腫瘤的進展。