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大家好呀，小編今天給大家?guī)?lái)的是2022年9月發(fā)表在nature communications(IF=17.694)上的一篇研究。作者通過(guò)研究RAS癌基因的活性，在肺腺癌中構(gòu)建了RAS84 成功預(yù)測(cè)了患者的預(yù)后及化療反應(yīng)。提前劇透一下，大部分是我們熟知的TCGA等公共數(shù)據(jù)哦！快來(lái)一起看看，作者是如何通過(guò)分析公共數(shù)據(jù)將文章登錄NC的吧！
一.研究背景
RAS癌基因在近20%的人類癌癥中發(fā)生突變，并作為腫瘤形成和進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)因素，KRAS是突變率最高的RAS亞型。大量的研究描述了突變KRAS在腫瘤侵襲性、轉(zhuǎn)移和化療耐藥中的重要作用，但是關(guān)于KRAS突變對(duì)患者結(jié)局或化療應(yīng)答的預(yù)測(cè)價(jià)值在發(fā)表的研究中缺乏共識(shí)。在作者之前的研究中，作者通過(guò)人和小鼠肺腺癌模型證明了KRAS突變促進(jìn)PD-L1表達(dá)，導(dǎo)致免疫逃逸。由于根據(jù)KRAS突變狀態(tài)對(duì)患者進(jìn)行的獨(dú)特分層可能使在大型患者隊(duì)列中進(jìn)行的RAS突變研究變得復(fù)雜，于是作者提出了一種基于RAS調(diào)控的轉(zhuǎn)錄活性的分層方法，預(yù)測(cè)肺腺癌和其他實(shí)體癌的預(yù)后和治療反應(yīng)。在這篇研究中，作者獲得了一個(gè)基因signature定義為RAS84，并構(gòu)建了一個(gè)分類器，通過(guò)腫瘤患者中RAS84的表達(dá)對(duì)患者進(jìn)行分層。通過(guò)這種方法，作者發(fā)現(xiàn)RAS轉(zhuǎn)錄活性可以預(yù)測(cè)肺腺癌和其他幾種實(shí)體癌的臨床結(jié)局。該方法提供了在大隊(duì)列患者中研究致癌RAS活性的影響的可能性，并有助于預(yù)測(cè)與致癌RAS活性相關(guān)的治療敏感性。
二.主要結(jié)果
由于KRAS可以改變并影響RAS通路活性，為了克服這一問(wèn)題，作者首先從已發(fā)表的數(shù)據(jù)以及作者針對(duì)KRAS和sh-KRAS數(shù)據(jù)重組的HCT116細(xì)胞系中確定RAS靶基因。主要關(guān)注的是RAS信號(hào)激活背景下上調(diào)的基因，因?yàn)榇蠖鄶?shù)signature只有上調(diào)的基因；為了減少腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的混雜信號(hào)的可能性，作者刪除了兩個(gè)免疫signature中的所有基因；最終確定的所有基因都由RAS的靶基因組成，與其他研究的signature幾乎沒(méi)有重疊。
1.利用肺細(xì)胞系表達(dá)數(shù)據(jù)構(gòu)建RAS84
作者最初的目標(biāo)是測(cè)量腫瘤細(xì)胞中的RAS通路活性。因此，作者將已建立的signature映射到CCLE的肺癌細(xì)胞系數(shù)據(jù)上，用來(lái)確定在不含基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的樣本中那些signature準(zhǔn)確的測(cè)定了致癌RAS的活性，以及已知KRAS突變是主要癌癥驅(qū)動(dòng)因素。作者首先通過(guò)去除細(xì)胞系中低表達(dá)的基因來(lái)清理特征，并刪除了除KRAS外具有致癌RAS通路突變的細(xì)胞系，將過(guò)濾后的CCLE肺癌細(xì)胞系特征表達(dá)矩陣聚類為三組。根據(jù)組內(nèi)signature基因的平均表達(dá)量將cluster命名為高RAS和低RAS，并將平均表達(dá)量中等的樣本組歸類為“未分類”。
利用KRAS突變?cè)诟逺AS和低RAS基因簇中的分布來(lái)評(píng)估signature捕獲RAS致癌活性的能力，作者發(fā)現(xiàn)“RAS通路”、“KRASG13D134”和“HRAS”是在高RAS組中富集KRAS突變的最佳signature(圖1a)。接下來(lái)作者對(duì)這些組進(jìn)行了差異基因分析，以確定在RAS高表達(dá)組細(xì)胞中上調(diào)的signature基因，進(jìn)一步改進(jìn)上述三個(gè)signature。從這些基因中，構(gòu)建了RAS84 signature，并在CCLE的肺癌數(shù)據(jù)集上進(jìn)行了測(cè)試(圖1b)。
RAS84成功將42株KRAS突變株中的36株納入RAS高表達(dá)組，6株未分類，0株為RAS低表達(dá)組。當(dāng)與其他RAS和致癌signature比較時(shí)，RAS84給出了統(tǒng)計(jì)上最可靠的KRAS突變細(xì)胞系與RAS-low組的分離(圖1d)。
2.RAS84表達(dá)可以在體外預(yù)測(cè)藥物敏感性和耐藥
為了確定RAS84的表達(dá)是否與抗癌藥物反應(yīng)相關(guān)，作者在RAS高和低的CCLE細(xì)胞系分組下分析了來(lái)自GDSC和CTRP數(shù)據(jù)庫(kù)的藥物敏感性數(shù)據(jù)，確定了兩組之間有差異應(yīng)答的藥物(圖2a)，并對(duì)不同反應(yīng)的藥物進(jìn)行了藥物靶標(biāo)terms富集(圖2b)。作者發(fā)現(xiàn)RAS高的細(xì)胞系對(duì)靶向ERK MAPK和EGFR信號(hào)通路的藥物敏感，也對(duì)蛋白穩(wěn)定性和降解的藥物敏感；DNA復(fù)制和有絲分裂是常見(jiàn)的化療靶點(diǎn)，表明RAS84活性在體外與化療耐藥相關(guān)。作者還檢測(cè)了KRAS突變(圖2c)和RAS通路突變依賴的藥物應(yīng)答(圖2d)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變組只對(duì)三種靶向ERK MAPK信號(hào)傳導(dǎo)的藥物敏感且未觀察到對(duì)任何藥物的耐藥性。這一結(jié)果表明，RAS84比單獨(dú)的KRAS突變或更廣泛的RAS通路突變更好地捕捉了RAS驅(qū)動(dòng)的藥物反應(yīng)。
3.肺腺癌中RAS84表達(dá)與KRAS突變相關(guān)
為了在細(xì)胞系之外進(jìn)一步驗(yàn)證RAS84，作者將其應(yīng)用于TCGA的LUAD數(shù)據(jù)上。鑒于與細(xì)胞系數(shù)據(jù)相比，在患者腫瘤樣本中觀察到的signature表達(dá)的異質(zhì)性增加，作者探索了不同于細(xì)胞系數(shù)據(jù)三分類的患者聚類，將TCGA數(shù)據(jù)的樣本聚類分成了五組(RAG0-4)(圖3a)，發(fā)現(xiàn)RAS84表達(dá)最低的一組中KRAS突變計(jì)數(shù)較低，其他的聚類都有高水平的KRAS突變，在25%到45%之間(圖3b)。作者使用上述各種特征對(duì)患者進(jìn)行了重新分組，發(fā)現(xiàn)RAS84對(duì)KRAS突變腫瘤分類最佳(圖3c)。
作者將每個(gè)患者RAS84基因的平均表達(dá)量定義為RAS84-Index(RI)值。為了進(jìn)一步確定這些組的特征，作者研究了在5個(gè)cluster中是否有其他報(bào)告的基因組改變表現(xiàn)出非隨機(jī)分布。確定了在一個(gè)或多個(gè)RAS activity groups (RAGs)中富集的8個(gè)突變(圖3d)，并使用這些與聚類相關(guān)的突變來(lái)表征五種RAGs。作者在一個(gè)包含87例肺腺癌患者的獨(dú)立隊(duì)列中驗(yàn)證了KRAS,EGFR和TP53在RAGs中的突變模式(圖3e)。
為了確定RAS84的表達(dá)是否反映了RAS-MAPK信號(hào)的活性，作者使用癌癥蛋白質(zhì)組圖譜(TCPA)反相蛋白陣列(RPPA)數(shù)據(jù)32對(duì)349例TCGA LUAD患者進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)與RAG-0相比，所有RAGs中一個(gè)或兩個(gè)蛋白的磷酸化增加(圖3f)。作者還確定了那些RAS84基因驅(qū)動(dòng)了RAGs，通過(guò)與聚類中變異最大的基因進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)7個(gè)小的基因cluster可以區(qū)分5個(gè)RAGs(圖3g)。綜上，作者證明RAS84在將KRAS突變型肺腺癌分類為具有RAS驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性的腫瘤方面表現(xiàn)最佳。
4.RAS84的表達(dá)大多是克隆性的
接下來(lái)的研究，作者主要探討RAS84的預(yù)后價(jià)值。理想情況下，可靠的生物標(biāo)志物不應(yīng)受到采樣區(qū)域的影響，因此不應(yīng)受到大多數(shù)癌癥中觀察到的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的干擾。于是為了評(píng)估肺腺癌中RAS活性的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，作者將來(lái)自多區(qū)域TRACERx隊(duì)列的樣本分為5個(gè)RAS活性組(來(lái)自41例患者的102個(gè)樣本)；通過(guò)TCGA LUAD分類結(jié)果訓(xùn)練支持向量機(jī)(SVM)分類器，并使用該分類器為T(mén)RACERx樣本分配RAG標(biāo)簽(圖4a)。作者觀察到與腫瘤間距離分布相比，RAS84在這些跨組腫瘤中的腫瘤內(nèi)差距仍然很小(圖4b)。
接下來(lái)作者通過(guò)與TRACERx肺腺癌隊(duì)列中先前注釋的表達(dá)異質(zhì)性的基因集進(jìn)行比較，評(píng)估了RAS84基因在腫瘤內(nèi)和腫瘤間的表達(dá)差異。先前的研究將所有表達(dá)的基因根據(jù)它們?cè)谀[瘤內(nèi)和腫瘤間的表達(dá)差異分為四組。作者發(fā)現(xiàn)RAS84基因在低腫瘤內(nèi)、高腫瘤間表達(dá)差異組中顯著富集3.2倍(圖4c)。這表明RAS84富集了抗樣本偏倚的基因?？傊@些數(shù)據(jù)表明RAS轉(zhuǎn)錄活性主要由肺腺癌腫瘤中克隆表達(dá)的基因組成，可能反映了RAS通路的致癌驅(qū)動(dòng)能力；并且面對(duì)抽樣偏差，RAS84特征可能是相對(duì)穩(wěn)健的。
5.RAS84預(yù)測(cè)肺腺癌患者的生存和化療反應(yīng)
在許多臨床前模型中，突變的KRAS癌基因促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，但在臨床數(shù)據(jù)集中，KRAS突變狀態(tài)與預(yù)后并不可靠的相關(guān)(圖5a)。為了確定RAS84在肺腺癌中是否具有預(yù)后價(jià)值，作者進(jìn)行了單變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析，比較了TCGA LUAD RAGs的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期。作者發(fā)現(xiàn)我們發(fā)現(xiàn)與RAG-0相比，RAG-4在總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期均與陰性結(jié)果顯著相關(guān)(圖5b、c)。
作者還對(duì)RAS84 RAS指數(shù)(RI)值進(jìn)行了單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析。作者發(fā)現(xiàn)與預(yù)后顯著正相關(guān)，表明RAS84表達(dá)增加是總生存率較差的預(yù)測(cè)因素。為了可視化RI預(yù)測(cè)結(jié)果的能力，作者使用該模型在RI值增加或減少兩倍的情況下預(yù)測(cè)生存時(shí)間(圖5d)，研究表明RAG是預(yù)后的重要預(yù)測(cè)因子，特別是RAG-4、RAG-3和RI與不良預(yù)后顯著相關(guān)(圖5e-h)；在校正其他預(yù)后預(yù)測(cè)因子的多變量分析中，結(jié)果表明只有RAS84顯著預(yù)測(cè)了預(yù)后(圖5i)。這表明RAS84在早期肺腺癌中具有超越已知臨床預(yù)測(cè)因子的預(yù)后特性，并提示RAS通路活性可以促進(jìn)人類肺腺癌的腫瘤進(jìn)展。
由于在體外觀察到一種化療耐藥表型，作者使用腺癌患者的TEMPUS隊(duì)列進(jìn)行了PFS多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析，作者選擇了接受過(guò)一線化療的患者，并利用患者記錄構(gòu)建了PFS間期。結(jié)果表明RAG是化療后PFS的重要預(yù)測(cè)因子，與RAG-2相比，RAG-3和RAG-4患者的反應(yīng)較差(圖5j)。最后，作者將RAS84與已發(fā)表的RAS特征進(jìn)行比較，以預(yù)測(cè)對(duì)化療的反應(yīng)，結(jié)果未能顯示RAS活性與治療耐藥的相關(guān)性(圖5k)。綜上，作者在來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立隊(duì)列的500多名肺腺癌患者中證明了RAG分類和RI量化的預(yù)后價(jià)值，還將RAG分類作為治療應(yīng)答的預(yù)測(cè)因子，從而證明了RAS84作為臨床危險(xiǎn)因素和應(yīng)答生物標(biāo)志物的價(jià)值。
6.RAS84可預(yù)測(cè)不同癌癥類型的RAS-MAPK通路活性
RAS活性在腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展中的重要程度因不同組織而異，已知一些癌癥主要是由RAS突變驅(qū)動(dòng)，如胰腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌。為了研究RAS84確定的RAS活性在不同癌癥類型之間的差異，作者在泛癌分析中量化了RAS84對(duì)所有32種TCGA實(shí)體癌的作用為了比較不同癌癥的樣本，作者計(jì)算了每個(gè)樣本的RI值(圖6a)，通過(guò)從每種癌癥的平均RI值分布中確定了兩種不同的癌癥人群(圖6b)。結(jié)果表明，在RAS高活性組中前五種RAS突變癌癥中有四種是RAS驅(qū)動(dòng)的(RAS基因突變率: 胰腺癌(PAAD) 71%,結(jié)腸腺癌(COAD) 50%,直腸腺癌(READ) 49%,肺腺癌(LUAD) 31%)。
接下來(lái)作者將RAS通路改變狀態(tài)定義為至少一種RAS通路基因改變導(dǎo)致通路激活的患者數(shù)量。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(圖6c)，胃癌(STAD)，膀胱癌(BLCA)，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSC)，食管癌(ESCA)和肺鱗狀細(xì)胞癌(LUSC)的RAS通路改變率均超過(guò)50%，表明是RAS通路的改變而不是RAS在這些癌癥中驅(qū)動(dòng)活性。圖6d顯示，在SKCM中RAS突變與RI不相關(guān)，而在THCA中呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)(圖6d)，這表明突變的RAS并不是這些癌癥中RAS通路活性的主要驅(qū)動(dòng)因素；作者還發(fā)現(xiàn)BRAF突變與高RI值顯著相關(guān)(圖6e)，這表明BRAF是這兩種癌癥中致癌RAS通路活性的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。作者確定RAS84表達(dá)除LUAD外與CESC和PAAD的預(yù)后相關(guān)(圖6f、g)。這一結(jié)果表明，RAS84定義的RAS活性在其他RAS驅(qū)動(dòng)的癌癥(如胰腺癌(PAAD))和RAS通路活性的癌癥(如宮頸癌(CESC))中可能是一個(gè)預(yù)后指標(biāo)。
至此，這篇文章就介紹完啦，內(nèi)容較多，我們來(lái)總結(jié)一下：第一步作者先在先前的研究基礎(chǔ)上確定了RAS的靶基因，并在肺癌細(xì)胞系的表達(dá)數(shù)據(jù)中構(gòu)建了RAS84；第二步，作者通過(guò)分析公共數(shù)據(jù)庫(kù)的藥物敏感性數(shù)據(jù)，確定了RAS84與藥物敏感型以及耐藥相關(guān)。第三步，作者在非體外的細(xì)胞系的TCGA等患者組織數(shù)據(jù)上進(jìn)一步驗(yàn)證RAS84效能，證明了其可以預(yù)測(cè)患者預(yù)后及化療反應(yīng)的作用；最后，將其擴(kuò)展到泛癌水平進(jìn)行多個(gè)癌癥中的討論。整體思路是我們熟悉的biomarker的研究思路，單個(gè)癌癥的證明+泛癌水平的討論，而且數(shù)據(jù)大部分也都是我們耳熟能詳?shù)腡CGA等公共數(shù)據(jù)。然而，這篇文章在2022年依然可以登上NC，小編認(rèn)為，這篇文章最大的亮點(diǎn)還是在于作者的書(shū)寫(xiě)表達(dá)，作者對(duì)于每一個(gè)結(jié)果的闡述非常完整，做到每個(gè)結(jié)果有理有據(jù)有總結(jié)，結(jié)果間的邏輯承接絲滑流暢，是一篇難得的好文章，推薦大家下載原文進(jìn)行閱讀學(xué)習(xí)哦！
