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當(dāng)前大家對(duì)中藥的探討如火如荼，關(guān)于中藥在臨床的研究也在不斷深入。那么，如何利用已有的數(shù)據(jù)評(píng)估中藥的療效呢？生信分析無疑是個(gè)非常不錯(cuò)的途徑，小編為大家整理了相關(guān)的研究思路。大體上可以分為這幾個(gè)部分：
第一部分，篩選中藥的活性成分及其靶基因；
第二部分，篩選差異基因進(jìn)行富集分析；
第三部分，構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)；
第四部分，通過分子對(duì)接驗(yàn)證活性；
如果繼續(xù)用常規(guī)思路來進(jìn)行中藥臨床研究，勢(shì)必很難發(fā)高分文章。今天小編就助大家一臂之力，挑選了一篇在中藥分析方面與眾不同的文章。這篇文章與上述思路不同的點(diǎn)是結(jié)合了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證部分，包括細(xì)胞層面和模式動(dòng)物，更加全面的分析了中藥對(duì)骨質(zhì)疏松的治療作用。
文章是利用生物信息學(xué)的方法分析了復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊（FTZ）對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制作用，破骨細(xì)胞分化是骨質(zhì)疏松癥的一個(gè)重要治療靶點(diǎn)。7月份發(fā)表在Aging，影響因子5.95。
下面我們來具體看一下文章的分析思路
一、復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊（FTZ）目標(biāo)預(yù)測(cè)與分析
采用UPLC/ Q-TOF-MS對(duì)口服FTZ后的有效成分進(jìn)行鑒定，篩選到26種活性成分。分析目標(biāo)基因得到593個(gè)活性成分作用的目標(biāo)基因。在這些活性成分中，原兒茶酸（PCA）的擁有最多的目標(biāo)基因（142個(gè)）。
圖1 活性成分與目標(biāo)基因互作網(wǎng)絡(luò)
二、破骨細(xì)胞生成相關(guān)的差異基因表達(dá)篩選
文章從不同的數(shù)據(jù)集中篩選到1733個(gè)特異表達(dá)的差異基因，并用Robust rank aggregation (RRA) 進(jìn)一步分析，得到52個(gè)差異表達(dá)基因，其中25個(gè)在破骨細(xì)胞生成過程中起到上調(diào)作用，27個(gè)起到下調(diào)的作用。對(duì)前50個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)破骨標(biāo)志物基因如Mmp9和Acp5在這三分?jǐn)?shù)據(jù)集中顯著增加，以此證明作者的分析是準(zhǔn)確可靠的。
作者還對(duì)這52個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行了富集分析，生物過程主要富集在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、髓細(xì)胞分化、破骨細(xì)胞分化、骨吸收和細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)，富集到的相關(guān)通路有TNF-α信號(hào)通路和破骨細(xì)胞分化。
圖2 前50個(gè)差異表達(dá)基因的熱圖
三、構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)
這部分作者對(duì)593個(gè)活性成分作用的目標(biāo)基因和篩選到的1733個(gè)特異表達(dá)的差異基因進(jìn)行比對(duì)，得到FTZ和破骨細(xì)胞相關(guān)基因之間77個(gè)共同作用靶點(diǎn)，這些共同靶點(diǎn)可能是FTZ抑制破骨細(xì)胞形成的基因。對(duì)這些基因進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)分析，Il6、IL10、Mmp9、Ptgs2和Il1β可能在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
圖3 抑制破骨細(xì)胞分化的77個(gè)候選靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)
四、候選靶基因富集通路分析
進(jìn)一步對(duì)77個(gè)候選靶基因的生物功能進(jìn)行研究。在富集到的生物過程中，炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)和氧化應(yīng)激反應(yīng)均被證實(shí)為與破骨細(xì)胞形成相關(guān)的關(guān)鍵過程。此外，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、髓細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和髓細(xì)胞分化在總的生物過程富集中被識(shí)別到。
接下來，通過KEGG富集研究復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊（FTZ）在通路水平上對(duì)破骨細(xì)胞形成的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示，77個(gè)靶點(diǎn)富集于93個(gè)信號(hào)通路。破骨細(xì)胞形成相關(guān)的TNF-α信號(hào)通路(hsa04668)是最重要的25個(gè)信號(hào)通路之一。
圖4 FTZ藥理靶標(biāo)基因與破骨細(xì)胞相關(guān)的77個(gè)共基因的富集
五、活性成分與目標(biāo)基因互相作用的驗(yàn)證
前面的結(jié)果確認(rèn)了TNF-α通路在破骨細(xì)胞形成中起關(guān)鍵作用，可能是復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊（FTZ）抑制破骨細(xì)胞形成的潛在治療機(jī)制。因此，作者進(jìn)一步研究了27個(gè)FTZ成分與6個(gè)TNF-α通路富集基因的聯(lián)合活性，包括Ptgs2、Pik3cb、Mmp9、Il1β、Il6和Fos。結(jié)果表明FTZ活性成分與TNF-α通路富集基因有良好的結(jié)合活性。值得注意的是，人參皂苷F1、Rb1、Rd與Mmp9、IL1β、IL6具有較高的親和能力，提示這些成分可能在FTZ的治療作用中發(fā)揮重要作用。這些對(duì)接結(jié)果在一定程度上證實(shí)了文章在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方面的可靠性。
圖5 TNF通路相關(guān)的活性成分和富集基因的對(duì)接模型
圖6 5種對(duì)接模式
六、復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊（FTZ）對(duì)體外破骨細(xì)胞生成的抑制作用
為了研究FTZ對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響，文章用RANKL誘導(dǎo)BMMs，并加入含有FTZ的血清進(jìn)行處理。8天后RANKL誘導(dǎo)，TRAP染色，顯微鏡下觀察，BMM細(xì)胞在RANKL刺激下分化為成熟的破骨細(xì)胞（圖7A）。然而這種分化可被FTZ血清顯著抑制（圖7B 7C）。MTS檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)TZ血清對(duì)BMMs無細(xì)胞毒性作用（圖7 G）。BMMS在RANKL和M-CSF誘導(dǎo)下分化為成熟破骨細(xì)胞具有較強(qiáng)的骨吸收能力。在FTZ血清的干預(yù)下，骨吸收活性顯著減弱(圖7D-7F)。RT-qPCR進(jìn)一步證實(shí)FTZ在基因表達(dá)水平上對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制作用，Mmp9、Trap、活化T細(xì)胞核因子表達(dá)水平明顯升高。
圖7 FTZ抑制破骨細(xì)胞功能及破骨特異性基因表達(dá)
七、復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊（FTZ）減輕卵巢切除誘導(dǎo)的體內(nèi)骨丟失
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)FTZ對(duì)體內(nèi)破骨細(xì)胞形成的治療作用，文章建立了卵巢切除術(shù)（OVX）小鼠模型。治療12周后處死小鼠，用Micro-CT和ELISA進(jìn)一步分析小鼠左股骨和血清。FTZ組小鼠血清E2水平較OVX組顯著升高。此外，F(xiàn)TZ可逆轉(zhuǎn)OVX誘導(dǎo)的血清TRAP、TNF-α、IL-6水平升高。
重建的3D圖像證實(shí)，OVX小鼠發(fā)生了顯著的骨丟失，這種現(xiàn)象可通過接受FTZ治療得到抑制。
圖8 FTZ治療可改善卵巢切除（OVX）誘導(dǎo)的體內(nèi)骨丟失
文章篩選復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊（FTZ）活性成分和其作用的靶基因，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行富集分析，進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊（FTZ）治療的骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。亮點(diǎn)是結(jié)合了生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證進(jìn)行全面分析。在中藥與疾病的作用關(guān)系方面提供了一個(gè)新的思路，對(duì)于研究中藥的小伙伴來說有著非常不錯(cuò)的借鑒意義。
