掃碼聯(lián)系客服
大家好呀，今天分享的文章題為scRNA-seq測序分析放射化療誘導的宮頸癌先天免疫激活和MHC-II上調(diào)，于今年一月發(fā)表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》（IF = 38.104）上，文章邏輯清晰，讓我們一起學習一下吧！
一、摘要
放化療（Radiochemotherapy，RCT）是宮頸癌（Cervical cancer，CC）的一種強有力的治療方法，它不僅影響惡性細胞，而且影響腫瘤的免疫和間質(zhì)室。了解RCT誘導的局部生態(tài)系統(tǒng)重構(gòu)將為改善宮頸癌的治療策略提供有價值的見解。在本研究中，作者將scRNA-seq應用于宮頸癌患者和鄰近正常宮頸組織的RCT前后腫瘤活檢樣本中，發(fā)現(xiàn)RCT后殘留的上皮細胞群顯示MHC-II類基因表達上調(diào)。此外，RCT導致了具有增加促炎特征的單核細胞髓系來源的抑制細胞（M-MDSCs）和具有更高細胞毒性基因表達特征的CD16+ NK細胞的積累，然而在RCT后，T細胞亞群的細胞毒性特征的表達沒有顯著增加。這些結(jié)果揭示了腫瘤生態(tài)系統(tǒng)對RCT的復雜反應，為宮頸癌中先天免疫的激活和MHC-II的上調(diào)提供了證據(jù)。
二、結(jié)果
1、利用單細胞轉(zhuǎn)錄組鑒定RCT期間CC動態(tài)變化
本研究在RCT治療前后對5例CC患者的10對腫瘤組織樣本進行取樣，又從兩個患者的鄰近正常組織樣本進行scRNA-seq檢測。此外，作者的目標是對2個驗證隊列進行驗證測試：驗證隊列1：15對用于免疫組化（immunohistochemistry，IHC）進行RCT前和RCT后的CC樣本，驗證隊列2：20對RCT前和RCT后的CC樣本的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)。經(jīng)過數(shù)據(jù)質(zhì)量控制得到60550個細胞進行后續(xù)分析，手動注釋成9個細胞簇：髓系細胞、T 細胞、漿細胞、B細胞、樹突狀細胞、血管成纖維細胞、基質(zhì)成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞。作者對接受RCT治療前后做成對比較，與預期的一樣，所有患者中上皮細胞的相對頻率均顯著降低，這與治療誘導的癌細胞壞死和凋亡相一致。此外，所有患者RCT后髓系細胞比例均顯著升高，表明髓系細胞募集并浸潤腫瘤，其它7簇細胞前后無顯著差異。（圖1）
2、上皮細胞亞型之間存在不同的RCT敏感性和免疫原性
本文將上皮細胞又重新分成了五個細胞簇，命名為Epi1-5。通過對這些簇差異表達基因的分析發(fā)現(xiàn)：間充質(zhì)細胞相關基因在Epi1中表達最多；免疫相關基因LCN2和DEFB1在Epi2中表達最多；而細胞周期基因TOP2A和MKI67在Epi5中表達最多；利用GSVA分析驗證了：(a) Epi1特征為WNT/β-連環(huán)蛋白和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；(b)補體和炎癥信號是Epi2的標志；(c) DNA修復和高S/G2M比值是Epi5的標志。RCT改變了5個亞群的相對比例，最明顯的是Epi2比例的增加和Epi3比例的減少。（圖1F-G）
本文通過對免疫相關的差異基因進行GO分析來研究RCT治療如何影響上皮細胞亞群的免疫應答相關特征，結(jié)果強調(diào)了RCT的整體免疫原性增強作用，具體而言，參與抗原呈遞和處理的基因，包括MHC-II，在整個上皮細胞和Epi1/ 4/5中顯著上調(diào)，而在Epi2/3中表達水平相對穩(wěn)定，只有Epi2顯示MHC-I表達部分下調(diào)。來自驗證隊列1的樣本的IHC染色證實了RCT后上皮細胞中MHC-II基因的上調(diào)。證明了RCT在上皮細胞中誘導了廣泛的免疫相關反應。那么RCT是如何影響上皮細胞亞群惡性特征的呢？評估發(fā)現(xiàn)RCT下調(diào)了與惡性CC特征相關的基因；在細胞周期方面，觀察到RCT前樣本中G2/S期基因的表達比例高于正常和RCT后樣本；評估了RCT誘導的每個上皮細胞亞群中腫瘤細胞數(shù)量的變化，并觀察到總體上的減少。值得注意的是，雖然在5個集群中的3個集群( Epi1/4/5)腫瘤細胞的比例下降到零，但在RCT后3周檢測到Epi2/3中仍存在大量的腫瘤細胞。雖然殘留的Epi2/3簇在那個時間點沒有增殖，但Epi2表達了相對較高水平的癌前和轉(zhuǎn)移前的標記基因。綜上所述，RCT誘導了上皮細胞中與免疫反應相關的基因表達的增加，特別是MHC-II。與此同時，仍有一個殘留的上皮細胞亞群，其特征是潛在的惡性標志和參與抗原呈遞的基因低表達。（圖2）
3、RCT誘導髓系細胞中促炎基因的表達
本文又將髓系細胞簇重新分成了7個細胞亞群，注釋成巨噬細胞，單核細胞髓系來源的抑制細胞（M-MDSCs）和樹突狀細胞。不同的細胞簇表現(xiàn)出不同的潛能，髓系細胞群可能同時包含促腫瘤和抗腫瘤亞型。為了進一步研究這一現(xiàn)象，作者研究促炎性M1和抗炎性M2相關的基因在巨噬細胞簇中的表達情況，發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞簇中表現(xiàn)出M1和M2的混合特征。在RCT后，F(xiàn)CN1_M-MDSC的相對比例顯著增加，而CD1C_DC的相對比例顯著下降。通過對來自驗證隊列1的樣本進行IHC和來自驗證隊列2的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)的RCT前后比較，發(fā)現(xiàn)在治療后FCN1_M-MDSC顯著增加。無論每個聚類的比例如何，RCT后所有聚類的促炎信號均升高，RCT顯著上調(diào)了參與趨化、抗原加工和呈遞的基因的表達；通過GO分析發(fā)現(xiàn)，RCT后M-MDSCs、巨噬細胞和樹突狀細胞中參與白細胞遷移和激活的基因表達增加。綜上所述，RCT通過誘導髓系細胞促炎基因表達，促進FCN1_M-MDSCs的積累和上調(diào)（FCN1m-MDSCs具有上調(diào)的促炎性和下調(diào)的抗炎性），從而改變CC腫瘤的免疫平衡。（圖3）
4、RCT對淋巴細胞室影響嚴重
在淋巴細胞中，NK和T細胞以其潛在的親腫瘤或抗腫瘤作用而聞名，本文識別到10個T細胞簇和2個NK細胞簇。RCT后CD16_NK細胞比例明顯增加，而CD56_NK細胞比例保持不變。使用GO分析NK細胞前和后的DEGs，發(fā)現(xiàn)RCT后NK亞群中與白細胞遷移相關的基因表達增加，CD16_NK細胞亞群中與細胞毒性相關的基因表達增加。CD16_NK細胞在RCT后顯示GZMB、GZMH和NKG7的表達增加，這些基因的蛋白產(chǎn)物在NK細胞的細胞毒性顆粒中表達，大多數(shù)患者這些細胞毒性基因表達增加，聯(lián)合bulk數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)細胞毒性基因的表達與患者的生存率呈正相關。在RCT后，CD4_naive細胞的比例顯著增加，而Exhausted_CD8_T細胞的比例顯著下降。抑制特征在所有T細胞亞簇中都被下調(diào)，但沒有發(fā)現(xiàn)細胞毒性評分的顯著增加。（圖4）
5、腫瘤相關成纖維細胞在RCT后表現(xiàn)出促瘤特征減少
成纖維細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展扮演重要角色，本文將成纖維細胞重新劃分成六個亞群：基質(zhì)癌相關成纖維細胞（mCAFs）、炎癥CAFs（iCAFs）、抗原提呈CAFs（apCAFs）、血管CAFs（vCAFs）。GO分析結(jié)果顯示： mCAFs富集在細胞外基質(zhì)組織和轉(zhuǎn)化生長因子反應，iCAFs富集在細胞趨化性，apCAF1富集在氧化應激反應，apCAF2富集在表皮發(fā)育，vCAF1富集在動脈發(fā)展，和vCAF2富集在細胞外基質(zhì)組織和細胞基質(zhì)粘附。由于CAFs介導了癌細胞對治療的反應，作者比較了RCT前后CAF亞群的特征。發(fā)現(xiàn)ipCAF2中iCAFs和apCAFs的相對比例顯著降低，而RCT中vCAF1的比例顯著增加。通過評估CAF亞群中特征基因集的表達，發(fā)現(xiàn)RCT后CAFs的血管生成特征減少，炎癥評分增加。
RCT治療后，幾乎所有的vCAF和apCAF亞群低表達基因集和血管生成相關，高表達基因集和炎癥相關。在RCT治療過程中，TNF和JAK/STAT通路表達上調(diào)，血管生成通路表達下調(diào)。血管生成和免疫抑制過程都促進腫瘤生長，這些數(shù)據(jù)表明RCT可能損害CAF群體的腫瘤促進能力。（圖5）
6、內(nèi)皮細胞在RCT中顯示血管生成、缺氧和炎癥基因表達增強
血管內(nèi)皮細胞對深刻影響腫瘤生長及其治療反應的因素做出反應，并產(chǎn)生它們。本文鑒定了5個具有不同轉(zhuǎn)錄特征的內(nèi)皮細胞亞群（ECs）。GO term分析顯示，EC1富集IFN-gamma通路和抗原加工和提呈，EC2富集上皮細胞遷移，EC3富集細胞-底物粘附，EC4富集DNA損傷檢查點，EC5富集白細胞趨化性。RCT期間EC2細胞比例明顯下降，但是RCT后EC2-4仍占所有EC的一半以上。事實上，與促血管生成CAF亞簇的存在相一致，RCT中與EC發(fā)育、血管重塑和缺氧相關的基因被富集，特別是EC2-4。值得注意的是，除了增強血管生成外，上皮細胞中參與上皮細胞增殖的基因的表達也顯著上調(diào)。此外，在RCT后，發(fā)現(xiàn)在上皮細胞中參與缺氧和血管生成以及炎癥的基因的富集，包括TNF/NF-kappa B和白細胞介素相關通路。這些基因與淋巴細胞和髓系細胞的抗腫瘤特征，以及TNF和白細胞介素激活ECs有關。EC的血管生成和促免疫特征使RCT對EC人群影響的解釋復雜化。（圖6）
7、細胞亞簇和細胞-細胞相互作用的臨床意義
為了研究細胞亞群的臨床意義，根據(jù)本文的單細胞數(shù)據(jù)，利用CIBERSORTx算法對TCGA數(shù)據(jù)進行反卷積評估細胞占比。發(fā)現(xiàn)vCAF2、Exhausted_CD8_T、EC2與CC患者的不良預后顯著相關，而GZMK_CD8_T與良好預后顯著相關。利用細胞配受體表達情況，研究RCT前后細胞互作網(wǎng)絡。RCT后，M-MDSCs、NK細胞和CAFs有更多的進入相互作用，而上皮細胞、T細胞和樹突狀細胞的相互作用較少。在外向相互作用方面，MMDSCs、NK細胞和巨噬細胞在RCT后的相互作用較少，而上皮細胞和CAFs的相互作用更多。為了研究免疫細胞是如何被招募的，觀察了RCT前后細胞簇之間趨化因子的配體-受體相互作用。與RCT前相比，RCT后上皮細胞與M-MDSCs（主要通過CCL2-CCR1/CCR2）相互作用更多，CAFs與M-MDSCs（主要通過CCL11-CCR2和CCL13- CCR1/CCR2）相互作用更多。對于NK細胞，RCT后發(fā)現(xiàn)CCL5-CCR1的相互作用更強。綜上所述，RCT影響了細胞簇之間的相互作用，這可能促進免疫細胞滲入TME。（圖7）
三、小結(jié)
這篇文章對比了RCT前后細胞比例和基因表達情況，發(fā)現(xiàn)：FCN1_M-MDSC的相對比例顯著增加，而CD1C_DC的相對比例顯著下降；CD16_NK細胞亞群中與細胞毒性相關的基因表達增加，在T細胞中并沒有發(fā)現(xiàn)這種狀況；成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)RCT后CAFs的血管生成特征減少，炎癥評分增加；內(nèi)皮細胞在RCT中顯示血管生成、缺氧和炎癥基因表達增強；并通過細胞配受體發(fā)現(xiàn)這些細胞是通過哪些趨化因子互作進行招募的。文章邏輯清晰，清晰地對比了RCT治療前后細胞、基因和相關通路活性的改變，對疾病進行治療前后的單細胞測序分析也是非常值得我們學習和借鑒的。
