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哈嘍，大家好，今天向大家分享的是近期發(fā)表在International Journal of Biological Sciences（IF：10.75）雜志上，縱觀全文，作者通過(guò)篩選基底膜（BM）相關(guān)的基因，并構(gòu)建了預(yù)后模型，無(wú)論在訓(xùn)練集還是驗(yàn)證集都得到了很好地結(jié)果，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了高基底膜基因評(píng)分（BMscore）可以促進(jìn)腫瘤遷移。
Novel Implication of the Basement Membrane for Breast Cancer Outcome and Immune Infiltration
摘要
乳腺癌患者的治療失敗在很大程度上歸因于術(shù)后進(jìn)展和治療抵抗。然而，一個(gè)有效的預(yù)后簽名識(shí)別這一人群是缺乏的?；啄?BM)已被證實(shí)與癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并有可能成為乳腺癌強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因子。本研究從TCGA-BRCA、METABRIC和GSE96058轉(zhuǎn)錄組學(xué)、單細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)和臨床信息，并進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線、單細(xì)胞分析和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證模型標(biāo)簽基因。
數(shù)據(jù)集：TCGA-BRCA訓(xùn)練集和METABRIC、GSE96058兩個(gè)驗(yàn)證集
關(guān)鍵詞：PFS:無(wú)進(jìn)展生存期；DFS：無(wú)病生存期；DSS：疾病特異性生存期
1.基因的選擇和BMscore的構(gòu)建
將BM基因和三個(gè)數(shù)據(jù)集基因取交集得到203個(gè)BM基因（圖1A），對(duì)這些基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，在TCGA-BRCA 中77個(gè)差異表達(dá)（圖1B-C）。同時(shí)，篩選了體細(xì)胞突變最多的前20個(gè)BM基因(圖1D)。然后通過(guò)單變量分析篩選和OS最相關(guān)的12個(gè)BM基因用于后續(xù)分析（圖1E）。通過(guò)LASSO Cox回歸分析鑒定出6個(gè)關(guān)鍵的BM基因，包括LOXL1、FBLN1、FBLN5、SDC1、ADAMTS8和PXDNL(圖1F-G)。分別研究了這6個(gè)關(guān)鍵基因在TCGA-BCRA中的相關(guān)性、表達(dá)和預(yù)后，總結(jié)了6個(gè)BM基因的染色體位置和表達(dá)水平，交互作用網(wǎng)絡(luò)和相關(guān)性（圖1H-I）。
基于TCGA-BRCA數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)和正常對(duì)照相比，乳腺癌中LOXL1、SDC1和PXDNL高表達(dá)，而FBLN1、FBLN5和ADAMTS8低表達(dá)，并通過(guò)RT-qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證了6個(gè)BM基因的表達(dá)情況(圖2A-B)。每個(gè)基因在不同的乳腺癌分子亞型中表現(xiàn)出不同的表達(dá)水平。（乳腺癌分子亞型購(gòu)自ATCC并按照相應(yīng)規(guī)則培養(yǎng)）
TCGA-BRCA中的KM曲線顯示，PXDNL和SDC1高表達(dá)，BLN1、FBLN5、LOXL1和ADAMTS8低表達(dá)的患者生存更差。根據(jù)lasso的結(jié)果構(gòu)建BMscore公式：BMscore=SDC1的表達(dá)* 0.1625 + PXDNL的表達(dá)* 0.0942 - ADAMTS8的表達(dá)* 0.1399 - LOXL1的表達(dá)* 0.1176 - FBLN5的表達(dá)* 0.0328 - FBLN1的表達(dá)* 0.0189。
2.BMscore預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后的有效性
為了驗(yàn)證BMscore預(yù)測(cè)預(yù)后的有效性，作者分別將訓(xùn)練集和測(cè)試集分成高低BMscore兩組（圖3A）。所有隊(duì)列中，高BMscore對(duì)應(yīng)低的生存時(shí)間（圖3B-C），KM曲線顯示BMscore越高患者OS概率越低（圖3D）。因?yàn)锽M可能參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，作者還對(duì)TCGA-BRCA的DFS、DSS和PFS進(jìn)行了KM生存分析結(jié)果顯現(xiàn)，BMscore高的乳腺癌患者的死亡率顯著增加，這意味著更不利的DFS（圖3E-F）。
3.全面研究BMscore指標(biāo)相關(guān)的基因
BMscore和乳腺癌生存相關(guān)，作者又分析了BMscore和臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。對(duì)于這些臨床病理參數(shù)，在TCGA-BRCA中，BMscore與T stage、等級(jí)和分子亞型顯著相關(guān)；METABRIC隊(duì)列中，BMscore與陽(yáng)性節(jié)點(diǎn)、等級(jí)和分子亞型顯著相關(guān)；GSE96058中，BMscore與陽(yáng)性節(jié)點(diǎn)、腫瘤大小和分子亞型顯著相關(guān)（圖4A-D）。結(jié)果顯示，BMscore和臨床指標(biāo)顯著相關(guān)，BMscore高的患者更容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和嚴(yán)重的臨床分期。
療效對(duì)于乳腺癌的研究有著重要作用，作者研究了療效和BMscore之間的關(guān)系，在TCGA-BRCA隊(duì)列中，發(fā)現(xiàn)除了放療外，高BMscore和化療和內(nèi)分泌療法治療后較差生存相關(guān)（圖5A-C）。在METABRIC隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)高BMscore的患者三種治療后預(yù)后更差（圖5D-F）。上述結(jié)果有效證明BMscore可以有效地預(yù)測(cè)乳腺癌患者的耐藥性。
4. 乳腺癌BMscore獨(dú)立預(yù)后價(jià)值的鑒定與評(píng)估
以上的結(jié)果證明了BMscore可以有效預(yù)測(cè)預(yù)后，作者又從多個(gè)角度進(jìn)行了評(píng)估，除BMscore外，同時(shí)納入多個(gè)危險(xiǎn)因素(年齡、T分期、N分期、M分期、PAM50亞型)，對(duì)TCGA-BRCA患者OS進(jìn)行單因素和多因素Cox分析。單因素分析確定BMscore、分期、年齡、N期和M期為OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(圖6A)，在多因素分析中，年齡和BMscore仍然是OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(圖6B)。結(jié)合年齡和BMscore構(gòu)建箱線圖和DCA曲線用來(lái)預(yù)測(cè)OS (圖6C-E)。ROC曲線顯示了預(yù)測(cè)結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性，特別是列線圖在三個(gè)隊(duì)列中預(yù)測(cè)效果都很準(zhǔn)確（圖6F）。列線圖在預(yù)測(cè)TCGA-BRCA患者的生存預(yù)后方面具有良好的敏感性和特異性（圖6G-I）。這些結(jié)果都證明BMscore可以作為一個(gè)獨(dú)立的乳腺癌預(yù)后指標(biāo)。
5. BMscore對(duì)乳腺癌免疫微環(huán)境的影響
腫瘤微環(huán)境在乳腺癌中起著關(guān)鍵作用，利用ESTIMATE評(píng)估評(píng)估腫瘤基質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分和ESTIMATE評(píng)分，并分析BMscore和三者之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)BMscore越高基質(zhì)評(píng)分越高（圖7A）。BM和免疫細(xì)胞都是腫瘤微環(huán)境中重要的組成部分，作者又使用CIBERSORT算法推斷了三個(gè)隊(duì)列中高低BMscore的免疫浸潤(rùn)情況，發(fā)現(xiàn)在TCGA-BRCA BMscore高組中，M0巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和靜息NK細(xì)胞顯著增加，而naive B細(xì)胞、靜息樹(shù)突狀細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、活化NK細(xì)胞、靜息的CD4+記憶T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加(圖7B)。同時(shí)，還分析了BMscore與免疫檢查點(diǎn)和細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性，顯示BMscore高和免疫檢查點(diǎn)分子CTLA4、IDO1、ICOS和PVR高表達(dá)正相關(guān)(圖7C)。以上提示，BMscore高的患者可能對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷治療，尤其是抗CTLA4治療更為敏感。在細(xì)胞因子方面， TNF、IL27和IL1B在高BMscore中高表達(dá)，而IL33和IL6相反（圖7D）。
作者又在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)和其他細(xì)胞類(lèi)型相比，BMscore在癌癥上皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞（CAFs）和漿母細(xì)胞中顯著差異（圖8A）。有利用?；鶊D畫(huà)出乳腺癌亞型、患者和細(xì)胞占比的對(duì)應(yīng)關(guān)系（圖8B）。發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞類(lèi)型BMscore不同，但是癌癥細(xì)胞中BMscore更高（圖8C），并發(fā)現(xiàn)6個(gè)模型基因的表達(dá)情況與上述研究一致（圖8D）。由于CAF的BMscore差異顯著，進(jìn)一步將CAF細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)BMscore高的細(xì)胞大多被注釋為myCAF-like細(xì)胞，這種細(xì)胞最集中在乳腺腫瘤的侵襲性部位(圖8E)。為了研究上皮細(xì)胞異質(zhì)性和BMscore、模型基因之間的相關(guān)性，將腫瘤上皮細(xì)胞分為高循環(huán)組和低循環(huán)組，并顯示各組BMscore的分布和模型基因的表達(dá)（圖8F-G）。
6. BMscore與EMT活性呈正相關(guān)
BM缺失是導(dǎo)致惡性腫瘤的重要步驟，作者又研究了BMscore與EMT之間的相關(guān)性，功能富集結(jié)果顯示，高BMscore組富集的標(biāo)志性通路包括根尖連接、凝血、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、糖酵解和mTORC1信號(hào)通路(圖9A)。高BMscore組顯著富集GO term包括表皮細(xì)胞分化、表皮發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、角化細(xì)胞分化和皮膚發(fā)育(圖9B)。高BMscore顯著富集的KEGG通路包括谷氨酸突觸、IL - 17信號(hào)通路、血小板活化、脂肪細(xì)胞脂解調(diào)節(jié)和金黃色葡萄球菌感染 (圖9C)。這些結(jié)果顯示BM在乳腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移發(fā)揮作用。分析BMscore與EMT之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，EMT途徑與FBLN1、FBLN5、LOXL1、SDC1的表達(dá)存在很強(qiáng)的正相關(guān)(圖9D)。
結(jié)合功能注釋結(jié)果，作者假設(shè)BMscore與EMT正相關(guān)，為了驗(yàn)證這一猜想，觀察了10個(gè)乳腺癌患者中6個(gè)模型基因的mRNA表達(dá)情況（圖10A）。計(jì)算這10個(gè)樣本的BMscore，并選擇最高和最低BMscore各三個(gè)樣本進(jìn)行免疫組化染色，查看Ki-76的表達(dá)情況和EMT標(biāo)記基因的表達(dá)情況（圖10B）。發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)在高BMscore的組織中相對(duì)更豐富，這揭示了BMscore和EMT活性之間的強(qiáng)烈正相關(guān)關(guān)系，BMscore高的乳腺癌患者可能有更大的EMT介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。
7. SDC1在BMscore中起關(guān)鍵作用，同時(shí)也是乳腺癌的腫瘤啟動(dòng)子
綜合以上結(jié)果，確定SDC1為與BMscore簽名相關(guān)的關(guān)鍵基因，并進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)。siRNA介導(dǎo)的敲除，MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中SDC1 mRNA水平降低(圖11A)。CCK8細(xì)胞增殖試驗(yàn)顯示，SDC1減少的MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞株的生長(zhǎng)均受到顯著抑制(圖11B)。從劃痕創(chuàng)面愈合(圖11C)和Transwell遷移試驗(yàn)(圖11D)可以發(fā)現(xiàn)，降低SDC1誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的遷移抑制。此外，在siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢測(cè)EMT標(biāo)記物的蛋白水平，以驗(yàn)證SDC1的改變是否導(dǎo)致了EMT標(biāo)記基因的改變。如預(yù)期的那樣，SDC1沉默抑制了snail、slug、N-cadherin和ZEB1的蛋白表達(dá)，而E-cadherin相應(yīng)增加(圖11E)。
小結(jié)
本文邏輯清晰，生信分析入手最后用濕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證模型基因。本文對(duì)乳腺癌的研究，從BM相關(guān)基因出發(fā)，構(gòu)建BMscore預(yù)測(cè)乳腺癌患者的生存。從多個(gè)角度驗(yàn)證了高低BMscore患者的異質(zhì)性，從免疫浸潤(rùn)、臨床指標(biāo)、腫瘤分期等等，又分析了BMscore和EMT之間的相關(guān)性，BMscore可以有效的預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移。本篇文章從模型基因的篩選以及模型構(gòu)建和評(píng)估，在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集都得到了很好的結(jié)果。首先BM相關(guān)基因的篩選是從訓(xùn)練集合驗(yàn)證集交疊基因取得，所以在后續(xù)進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)不會(huì)出現(xiàn)模型基因在驗(yàn)證基因沒(méi)有表達(dá)的情況。作者在設(shè)計(jì)試驗(yàn)和分析方法上都是值得我們學(xué)習(xí)的！
