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癌細(xì)胞耐藥性和可塑性是導(dǎo)致癌癥治療失敗的主要原因，而研究治療過(guò)程中腫瘤內(nèi)細(xì)胞亞群的進(jìn)化對(duì)解析癌癥耐藥性及可塑性至關(guān)重要。因此，小編今天和大家分享一篇今年10月剛剛發(fā)表在Genome Medicine（IF：15.266）雜志上關(guān)于細(xì)胞進(jìn)化與耐藥的文章。文章提出了一種新的策略，可以根據(jù)患者特異性腫瘤亞群在放療（RT）或細(xì)胞毒性治療時(shí)發(fā)生的變化來(lái)設(shè)計(jì)癌癥治療。文章聚焦腫瘤內(nèi)細(xì)胞進(jìn)化與耐藥性的關(guān)聯(lián)，邏輯清晰，角度新穎，有理有據(jù)，很具有參考及啟發(fā)意義。
Computational quantifcation and characterization of independently evolving cellular subpopulations within tumors is critical to inhibit anti-cancer therapy resistance
定量及刻畫(huà)腫瘤內(nèi)獨(dú)立進(jìn)化的細(xì)胞亞群對(duì)抑制抗癌治療耐藥性至關(guān)重要
一．研究背景
目前耐藥性是限制抗癌療法效果的主要因素，引起癌癥耐藥的一個(gè)主要原因是癌癥的可塑性，即一種癌癥亞型會(huì)根據(jù)治療的不同而轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N癌癥亞型，例如，三陰性乳腺癌（TNBC）在治療過(guò)程中可能會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)镠er2陽(yáng)性乳腺癌。此外，腫瘤診斷的準(zhǔn)確性和后續(xù)治療的決策對(duì)治療效果至關(guān)重要。因此，該研究評(píng)估了一種新的方法來(lái)刻畫(huà)治療誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞亞群進(jìn)化，并對(duì)癌癥治療耐藥的機(jī)制進(jìn)行了解析。
二．文章摘要
該研究基于信息論開(kāi)發(fā)了一種能夠探索腫瘤組成的單細(xì)胞量化策略，且該策略有助于抗癌療法的高分辨率及個(gè)性化評(píng)估。該單細(xì)胞量化策略首先構(gòu)建每個(gè)細(xì)胞的特異性信號(hào)特征（CSSS），然后基于CSSS計(jì)算細(xì)胞的條碼（barcodes）。最后使用基于CSSS的barcodes揭示腫瘤內(nèi)為響應(yīng)外部影響而產(chǎn)生的進(jìn)化，并據(jù)此進(jìn)一步為腫瘤分配靶向藥物來(lái)優(yōu)化腫瘤治療。此外，研究也通過(guò)TNBC模型和放療中存在表型切換的患者對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。
三．研究的主要內(nèi)容及結(jié)果
1. 研究的總體流程
文章首先對(duì)研究的總體流程進(jìn)行了介紹，該研究主要分為4部分：1）首先是通過(guò)文獻(xiàn)檢索確定了能夠用于單細(xì)胞定量和分析的乳腺癌細(xì)胞表面標(biāo)記物。2）接著使用靶向細(xì)胞表面癌蛋白的熒光標(biāo)記抗體對(duì)單細(xì)胞懸液進(jìn)行標(biāo)記，并檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞的癌蛋白的表達(dá)水平（圖1A）。3）接著應(yīng)用單細(xì)胞驚異分析（Surprisal analysis；SA）來(lái)識(shí)別每個(gè)細(xì)胞的特異性信號(hào)特征（CSSS），進(jìn)而識(shí)別腫瘤內(nèi)不同的細(xì)胞亞型（圖1B）。4）最后進(jìn)行了一系列體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證（圖1C）。
2. CSSS分析
這一部分作者對(duì)CSSS分析過(guò)程進(jìn)行了詳細(xì)介紹。研究首先對(duì)乳腺癌相關(guān)的癌標(biāo)志物進(jìn)行文獻(xiàn)搜索并選擇了11個(gè)細(xì)胞表面蛋白進(jìn)行單細(xì)胞量化。這11個(gè)標(biāo)志物為Her2、EGFR、EpCAM、CD44、CD24、PD-L1、cKit、CD133、E-Cadherin、cMet和MUC1。其中EGFR, Her2, MUC1,cMet和cKit與侵襲性表型的乳腺癌增殖相關(guān)；EpCAM, E-Cadherin, CD133, MUC1,cMet和cKit則與癌癥轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)；而CD44, CD24, CD133與干細(xì)胞特性相關(guān)；PD-L1則與免疫應(yīng)答有關(guān)；此外，Her2, cMet, EGFR, MUC1, cKit, PD-L1也是乳腺癌治療的潛在藥物靶點(diǎn)。接下來(lái)，研究使用多色流式細(xì)胞熒光分選（FACS）方法對(duì)單細(xì)胞中的這11個(gè)標(biāo)志物進(jìn)行定量（圖2A），并據(jù)此對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行SA分析（圖2B，C）。接著研究保留細(xì)胞具有顯著振幅的過(guò)程，進(jìn)而識(shí)別了細(xì)胞特異性過(guò)程，并稱之為“細(xì)胞特異性信號(hào)特征”（CSSS）（圖2D）。此外，研究為了簡(jiǎn)化將每個(gè)CSSS轉(zhuǎn)換為細(xì)胞特定的條碼，圖形化地表示細(xì)胞中的一組活動(dòng)過(guò)程（圖2D）。接下來(lái)，研究基于細(xì)胞匹配的CSSS識(shí)別了不同的亞群（圖2E），并研究了CSSS與治療策略的關(guān)聯(lián)（圖2F）。
3. 在4T1小鼠的TNBC細(xì)胞中10個(gè)不平衡過(guò)程會(huì)引起11種細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)變化
這一部分研究使用TNBC模型對(duì)不平衡過(guò)程與細(xì)胞表面蛋白的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了介紹。研究中使用的第一個(gè)TNBC模型中包括4T1細(xì)胞，該細(xì)胞來(lái)源于小鼠的乳腺腫瘤代表IV期的TNBC。研究發(fā)現(xiàn)Her2和cMet表達(dá)水平（圖3A）以及其他標(biāo)記物會(huì)在放療（RT）的作用下發(fā)生改變，不過(guò)cMet和Her2的表達(dá)相關(guān)性不顯著（圖3B），相反地EGFR和Her2及MUC1和cMet則表現(xiàn)出很強(qiáng)的相關(guān)性（圖3C，D）。接下來(lái)為了探索所有可能的蛋白與蛋白之間的關(guān)系，研究進(jìn)行了單細(xì)胞SA分析，該方法可以識(shí)別和定位在整個(gè)細(xì)胞群和每個(gè)細(xì)胞中發(fā)生的不平衡過(guò)程，結(jié)果在細(xì)胞群中識(shí)別了10個(gè)不平衡過(guò)程，作者展示了4個(gè)出現(xiàn)在大于1%的細(xì)胞中的過(guò)程（圖3F）。其中過(guò)程3和8包括Her2和EGFR及cMet和MUC1的誘導(dǎo)（圖3F）。
4. 在RT反應(yīng)中觀察到Her+和cMet+亞群的擴(kuò)張
由于每個(gè)細(xì)胞中可能存在多個(gè)不平衡過(guò)程，因此這一部分作者對(duì)每個(gè)細(xì)胞的CSSS進(jìn)行分析，并揭示了基于CSSS的細(xì)胞亞群。研究首先在RT前后的細(xì)胞群中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)優(yōu)勢(shì)亞群，并將每個(gè)亞群進(jìn)行編碼（圖3G）。接下來(lái)研究分析了放療時(shí)間與優(yōu)勢(shì)亞群的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞群c在放療6天后下降。然而，亞群b和f在放療6天后顯著增加（圖4A）。其中，亞群b中只存Her2和EGFR誘導(dǎo)相關(guān)的過(guò)程3，而亞群f中只存在cMet和MUC1誘導(dǎo)相關(guān)的過(guò)程8（圖4A）。這種在放療后的Her2+和cMet+亞群的擴(kuò)張表明，Her2和cMet信號(hào)通路可能在4T1細(xì)胞的生存和對(duì)RT的抵抗中發(fā)揮重要作用。接下來(lái)，為了刻畫(huà)擴(kuò)張的Her2+和cMet+亞群在RT反應(yīng)中的增殖特性，研究使用免疫熒光法將4T1細(xì)胞群與抗ki67（增殖生物標(biāo)志物）、抗cMet和Her2抗體聯(lián)合染色。結(jié)果在存活的RT細(xì)胞中觀察到Ki67、Her2和cMet的表達(dá)顯著增加（圖4B、C、E和F）。此外，Her2和Ki67蛋白以及cMet和Ki67蛋白也協(xié)同增強(qiáng)（圖4D，E）。
5. 同時(shí)抑制Her2和cMet可致敏4T1 TNBC模型的RT治療
這一部分，作者對(duì)Her2和cMet抑制與4T1 TNBC模型的RT治療敏感性的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了分析。研究從放療前3天開(kāi)始直到放療后6天，單獨(dú)或聯(lián)合抑制每種蛋白質(zhì)，之后測(cè)量細(xì)胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Her2抑制劑和cMet抑制劑在使細(xì)胞對(duì)RT敏感方面顯示出協(xié)同效應(yīng)（圖4H）。這兩種抑制劑與RT的聯(lián)合使用增加了細(xì)胞死亡，并減少了下游對(duì)Her2和cMet的信號(hào)傳導(dǎo)（圖4I）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，作者將4T1細(xì)胞植入小鼠，并對(duì)腫瘤采用放療（圖5A），接著切除4T1腫瘤對(duì)單細(xì)胞懸液進(jìn)行分析，結(jié)果觀察到腫瘤在放療初始收縮（圖5B），后續(xù)則發(fā)生亞群b和f的擴(kuò)張（圖5C）。此外，在放療后12天腫瘤恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)（圖5B），這些擴(kuò)張的亞群仍然能夠被檢測(cè)到（圖5C）。此外，研究也觀察到抑制Her2和cMet蛋白（5D）會(huì)顯著使腫瘤對(duì)放療敏感（圖5E），且聯(lián)合治療會(huì)導(dǎo)致腫瘤縮小，并阻止RT耐藥的發(fā)展（圖5E）。此外，在RT之前加入靶向藥物組合，也會(huì)使b和f亞群的大小顯著減少（圖5F）。
6. 靶向Her2和cMet使人細(xì)胞系和患者源性TNBC對(duì)RT敏感
這一部分為了進(jìn)一步驗(yàn)證Her2+和cMet+細(xì)胞亞群的擴(kuò)張與TNBC的關(guān)聯(lián)，研究納入了TNBC人源性細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468以及TNBC患者源性細(xì)胞（BR45）進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果在放療后6天，觀察到所有類型的細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，隨后在放療后14天出現(xiàn)顯著的細(xì)胞再生（圖6A）。而且在所有細(xì)胞類型中，b和f亞群在放療后6天擴(kuò)張，在放療14天后要么保持其大小，要么擴(kuò)張（圖6B）。接下來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)抗Her2和抗Met的聯(lián)合預(yù)處理能夠使3種類型的人TNBC細(xì)胞對(duì)RT敏感（圖6C）。此外，與兩種藥物與RT聯(lián)合使用相比，每一種藥物單獨(dú)對(duì)細(xì)胞存活的影響明顯較小（圖6C）。進(jìn)一步當(dāng)細(xì)胞被抗Her2和抗cMet預(yù)處理時(shí)，研究觀察到下游的Her2和cMet信號(hào)通路損耗（圖6D）。接下來(lái)，研究使用患者源性TNBC BR45細(xì)胞，證明了放療的BR45 TNBC會(huì)在短時(shí)間內(nèi)對(duì)放療產(chǎn)生耐藥性（圖6E）。接著研究在放療前單獨(dú)用每種藥物對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)在一定程度上被抑制（圖6E）。然而，作者聯(lián)合使用這兩種藥物對(duì)小鼠的處理時(shí)，則觀察到它們展示出與放療顯著的協(xié)同效應(yīng)，腫瘤顯著縮小且耐藥的發(fā)展也受到抑制（圖6E）。此外，當(dāng)靶向聯(lián)合藥物在放療前應(yīng)用時(shí)，b和f亞群也減少（圖6F）。
到這里這篇文章的主要內(nèi)容就介紹完了，文章開(kāi)發(fā)了一種在單細(xì)胞水平探索腫瘤內(nèi)部進(jìn)化異質(zhì)性的方法，并以乳腺癌為例探索了治療誘導(dǎo)的腫瘤進(jìn)化與耐藥性的關(guān)聯(lián)，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。文章內(nèi)容豐富，干濕結(jié)合，有理有據(jù)，對(duì)外部影響誘導(dǎo)的腫瘤進(jìn)化進(jìn)行了詳細(xì)刻畫(huà)，文章將腫瘤進(jìn)化與耐藥聯(lián)合分析的研究思路值得我們參考。
