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在組成細(xì)胞的生物分子中，脂質(zhì)通常比蛋白質(zhì)和核酸受到更少的關(guān)注。有研究證明脂質(zhì)代謝的改變與癌癥的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)。今天小編給大家介紹一篇2023年3月發(fā)表在BMC cancer（IF:4.638）上一篇名為OSBPL家族基因在肝癌中的表達(dá)、免疫浸潤、預(yù)后及實驗驗證的文章，文章充分利用了公共數(shù)據(jù)庫的資源，邏輯清晰，實驗完整，下面讓我們詳細(xì)的看一下吧。
一、背景
脂質(zhì)（Lipids）具有豐富多樣的生物學(xué)功能，既能作為儲能物質(zhì)，又能充當(dāng)信號分子，還是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵成分。有研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝的改變與癌癥的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)。腫瘤微環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的可用性不斷變化，癌細(xì)胞利用脂質(zhì)代謝獲取癌細(xì)胞增殖、存活、侵襲、轉(zhuǎn)移以及對腫瘤微環(huán)境和癌癥治療響應(yīng)所需要的能量、生物膜成分和所需的信號分子。
氧固醇結(jié)合蛋白樣（OSBPL）家族是真核生物中脂質(zhì)結(jié)合/轉(zhuǎn)移蛋白（LTP）的最大家族之一，參與脂質(zhì)結(jié)合和轉(zhuǎn)運，OSBPL家族位于細(xì)胞膜上，在細(xì)胞器之間交換分子或信號，并作為的必要轉(zhuǎn)運蛋白，在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用。OSBPL蛋白家族包括9個成員，分別是OSBPL2、OSBPL3、OSBPL5、OSBPL6、OSBPL7、OSBPL8、OSBPL9、OSBPL10和OSBPL11。本文作者將目光投向了OSBPL家族，探究其在肝癌的基因表達(dá)、免疫浸潤和預(yù)后等方面的影響。
二、主要思路
圖1 本實驗設(shè)計流程圖
本文通過分析RNA-seq數(shù)據(jù)和CPTAC的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，分別評估肝臟腫瘤和正常組織中OSBPLs的表達(dá)差異。隨后對遺傳變異、潛在功能富集分析和免疫細(xì)胞浸潤進(jìn)行分析。此外，通過構(gòu)建LASSO模型和進(jìn)行受試者工作特征曲線(ROC)分析，確定OSBPLs的預(yù)后影響。并選取10例局部肝癌標(biāo)本，通過免疫組化(IHC)方法驗證OSBPL3的表達(dá)。最后通過CCK-8、細(xì)胞周期、凋亡、RT-qPCR、蛋白印跡等方法探討OSBPL3在肝癌細(xì)胞中的功能。
三、主要結(jié)果
1. 肝癌組織中OSBPLs的mRNA和蛋白表達(dá)
本文通過分析TCGA數(shù)據(jù)中肝臟腫瘤和與其匹配的正常組織(50對)中OSBPLs的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OSBPL2、OSBPL3、OSBPL5、OSBPL7、OSBPL8和OSBPL9均上調(diào)(圖2a)。為了進(jìn)一步證實它們在更大隊列中的表達(dá)，本文使用了160例正常腫瘤和371例TCGA和GTEx腫瘤樣本，發(fā)現(xiàn)OSBPL2、OSBPL3、OSBPL8在肝臟腫瘤中過表達(dá)，而OSBPL6在肝臟腫瘤中下調(diào)(圖2b)。
利用CPTAC數(shù)據(jù)庫檢測肝臟腫瘤組織和正常組織中OSBPLs的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤樣本中OSBPL2、OSBPL3蛋白表達(dá)升高，而OSBPL5、OSBPL6、OSBPL9、OSBPL10、OSBPL11蛋白表達(dá)低(圖2c)。
綜上所述，本文認(rèn)為OSBPL2、OSBPL3和OSBPL6可能與肝癌的進(jìn)展有關(guān)。
圖2 OSBPLs在肝臟腫瘤組織和正常組織中的mRNA和蛋白表達(dá)
2. 肝癌組織中CNV、甲基化與OSBPLs mRNA表達(dá)的關(guān)系
接下來本文使用了GSCA在線數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫匯集了包括CNV、突變、甲基化和免疫在內(nèi)的各種腫瘤基因組數(shù)據(jù)，用于評估OSBPLs的CNV和甲基化水平。
對肝癌組織進(jìn)行了拷貝數(shù)變異（CNV）分析，發(fā)現(xiàn)OSBPL2、OSBPL3和OSBPL7的CNV均以擴(kuò)增為主。而OSBPL5和OSBPL9的CNV主要是缺失(圖3a)。OSBPL2、OSBPL8、OSBPL9、OSBPL11的表達(dá)與CNV呈正相關(guān)(圖3b)。隨后本文評估了DNA甲基化與OSBPLs表達(dá)之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)甲基化水平與OSBPLs的表達(dá)總體呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(圖3c)。計算腫瘤DNA甲基化與正常DNA甲基化的差異。本文發(fā)現(xiàn)肝臟腫瘤中OSBPL3和OSBOL9的DNA甲基化表達(dá)明顯低于正常組織，而OSBPL5和OSBPL7的DNA甲基化表達(dá)明顯高于正常組織(圖3d)。
以上結(jié)果表明，CNV擴(kuò)增主要導(dǎo)致OSBPL2的過表達(dá)，而DNA甲基化可能導(dǎo)致OSBPL3的高表達(dá)。
圖3 肝癌組織中OSBPLs的CNV和DNA甲基化差異
3. 肝癌組織中OSBPLs表達(dá)與免疫浸潤的關(guān)系
作者通過TIMER數(shù)據(jù)庫確定OSBPLs表達(dá)與免疫浸潤之間的相關(guān)性。作者在這里使用了StromalScore、ImmuneScore和EstimateScore三種不同的策略計算OSBPLs的免疫評分，結(jié)果顯示OSBPL3、OSBPL5、SOBPL7和OSBPL10與免疫浸潤顯著正相關(guān)(圖4a)。隨后，作者還評估了OSBPL3、OSBPL5、SOBPL7、OSBPL10的表達(dá)與不同免疫細(xì)胞類型浸潤的關(guān)系。結(jié)果顯示，OSBPL3、OSBPL5、SOBPL7、OSBPL10的表達(dá)與腫瘤純度、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤水平顯著相關(guān)(圖4b)。
圖4 OSBPLs表達(dá)與免疫浸潤的相關(guān)性
4. 生存模型構(gòu)建與分析
作者為了評估基因表達(dá)對總生存率（OS）的貢獻(xiàn)，將OSBPLs成員輸入LASSO回歸模型，生成兩個關(guān)鍵基因OSBPL3和OSBPL10(圖5a-b)。根據(jù)風(fēng)險評分將肝癌患者分為高組和低組，發(fā)現(xiàn)高組患者的生存期明顯短于低組(圖5c)。此外，作者還構(gòu)建了LASSO回歸模型來評估基因表達(dá)對疾病特異性生存期（DSS）的影響，其中OSBPL3和OSBPL6是兩個關(guān)鍵候選基因(圖5d-e)?；颊咭脖环譃楦?、低風(fēng)險評分組，與低風(fēng)險組相比，高風(fēng)險組DSS較差(圖5f)。
在這兩個LASSO模型中，OSBPL3是唯一與OS和DSS都相關(guān)的基因，表明OSBPL3是肝癌的預(yù)后因素。
圖5 OSBPLs相關(guān)風(fēng)險評分構(gòu)建。
5. OSBPL3在肝癌中的表達(dá)驗證
作者進(jìn)行了ROC分析，評估OSBPL3對肝癌的診斷效力，結(jié)果顯示OSBPL3是一個較強的預(yù)測因子(AUC=0.921, CI= 0.883-0.959)(圖6a)。基于以上所有結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)OSBPL3在肝癌中過表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)，假設(shè)OSBPL3可能在肝癌的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了驗證這一猜想，作者分析了4組GEO數(shù)據(jù)集進(jìn)行OSBPL3在肝癌中的表達(dá)驗證，結(jié)果顯示腫瘤樣本中OSBPL3 mRNA顯著升高(圖6b)。
接下來作者通過免疫組化實驗驗證OSBPL3的表達(dá)，共使用10例與正常相鄰組織相匹配的肝癌樣本，發(fā)現(xiàn)OSBPL3蛋白在10個局部肝臟腫瘤樣本中也有高表達(dá)(圖6c)。
圖6 OSBPL3在肝癌中的表達(dá)驗證
6. OSBPL3在肝癌組織中的GSEA分析
為了更好地了解OSBPL3在肝癌發(fā)生中的潛在機制，作者利用RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)相關(guān)性分析和差異表達(dá)基因(DEGs)分析。共鑒定出4441個DEG和2986個與OSBPL3相關(guān)的基因(圖7a-b)。為了進(jìn)一步鑒定OSBPL3的功能相關(guān)基因，作者將上調(diào)的DEGs與正相關(guān)基因進(jìn)行交叉，得到353個交叉基因(圖7c)。隨后對這353個基因進(jìn)行GSEA分析，結(jié)果顯示細(xì)胞周期和細(xì)胞外基質(zhì)組織通路明顯富集(圖7d)。
圖7 OSBPL3功能相關(guān)基因的GESA分析
7. OSBPL3在肝癌細(xì)胞中的功能分析
細(xì)胞周期失調(diào)和細(xì)胞外基質(zhì)重塑是其重要特征。鑒于GSEA的數(shù)據(jù)，作者試圖確定OSBPL3在細(xì)胞增殖和遷移調(diào)節(jié)中的作用。首先在肝癌細(xì)胞系中檢測OSBPL3的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，與其他5種肝癌細(xì)胞系相比，OSBPL3在PLC/PRF/5中高表達(dá)(圖8a)。因此，作者選擇了PLC/ PRF/5進(jìn)行進(jìn)一步的實驗。最終發(fā)現(xiàn)敲除OSBPL3可顯著抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期阻滯(圖8b-c)。干擾OSBPL3也促進(jìn)了明顯的凋亡(圖8d)。在OSBPL3 siRNA處理后，促凋亡蛋白包括Bax、PARP和cleaved caspase-3被激活(圖8e)。此外，轉(zhuǎn)染OSBPL3 siRNA后，細(xì)胞遷移明顯受阻(圖8f)。
圖8 敲除OSBPL3抑制細(xì)胞增殖和遷移
四、小結(jié)
總之，作者評估了肝癌的表達(dá)、基因組和表觀基因組變異。本文分析思路清晰，邏輯縝密，用簡單的生物信息學(xué)方法闡述了OSBPL家族在肝癌中的主要表達(dá)方式，免疫浸潤模式以及找到了一個重要OSBPL家族成員OSBPL3作為重要的預(yù)后特征，并分別使用其他數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)及免疫組化實驗對其進(jìn)行了驗證，最后通過結(jié)合功能富集和基因敲除實驗確定了下調(diào)OSBPL3可誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期阻滯和凋亡，抑制細(xì)胞遷移。
