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肝內膽管癌的免疫亞群具有治療異質性
免疫微環(huán)境被公認為是各種癌癥的關鍵調節(jié)因素。肝內膽管癌（iCCA）的特點是腫瘤反應性環(huán)境，強調對其免疫基因組學特征的深入了解，以提供癌癥的預后和治療意義。今天分享一篇2022年7月發(fā)表在Journal for ImmunoTherapy of Cancer (IF:12.469)雜志的文章。 這篇文章綜合多模塊數(shù)據(jù)確定了三個具有不同臨床、遺傳和分子特征的免疫亞群，這些免疫亞群與預后明顯相關。
背景
肝內膽管癌（iCCA）占所有原發(fā)性肝癌的10%-15%，在過去幾十年中逐漸增加。盡管術后復發(fā)率很高，但對于早期診斷的患者來說，手術是優(yōu)先考慮的治療方法。但是，大多數(shù)患者被診斷為晚期，此時只能進行保守性化療，其中位生存期短于12個月。iCCA的特點是高度脫髓鞘的腫瘤微環(huán)境（TME），有過多的免疫和基質細胞浸潤?，F(xiàn)有證據(jù)表明，炎癥微環(huán)境與iCCA的進展和不良預后有關，突出了TME是治療iCCA的一個關鍵。因此，迫切需要更好地了解免疫基因組學特征，以設計新的免疫療法，改善病人的預后。
基于免疫譜的患者分層有助于劃分免疫異質性腫瘤，并確定適合免疫治療的患者。已經有研究應用大量的腫瘤轉錄組或蛋白質組譜來定義臨床相關的iCCA亞型，揭示腫瘤間免疫異質性。但目前仍需要對臨床前模型和患者樣本進行多維度和多模塊的綜合分析，以深入了解免疫學特征，并確定iCCA各分子亞型的新型個性化免疫治療機會。
在這項研究中，作者利用最大的單中心iCCA隊列分析了TME的轉錄組圖譜，并將255名患者分為三個免疫亞組（IG1、IG2、IG3）。通過整合多種互補方法，包括全外顯子組測序（WES）、蛋白質組學、單細胞RNA測序（scRNA-seq）、免疫染色和小鼠模型，劃定了這些亞組之間不同的遺傳和分子特征。IG1是一個免疫抑制的亞組，預后最差，擁有最高的骨髓浸潤和KRAS突變；IG2的特點是腫瘤增殖和抗原表達缺陷；IG3的特點是抗腫瘤免疫的激活和三級淋巴結構（TLSs）的富集，預后良好。免疫學特征的巨大差異表明，每個免疫亞組都需要特定的治療策略。
主要結果
以免疫為中心的iCCA分類
為了研究具有預后意義的iCCA的免疫特征，作者獲得了來自復旦大學(FU- iCCA)隊列(n=255)的多組學數(shù)據(jù)。與iCCA的炎癥和促結締組織增生特征一致，在癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)泛癌癥數(shù)據(jù)集中，有相對較高的免疫浸潤。基于來自TME signature的170個預后基因的mRNA水平，無監(jiān)督的層次聚類揭示了三個免疫亞組，即IG1、IG2和IG3(圖1A)。通過對signature的轉錄組和蛋白質組數(shù)據(jù)進行配對，產生了103對mRNA -蛋白質對，總體上顯示出正相關。免疫亞組在總生存期和無復發(fā)生存期方面存在明顯差異，其中IG1的預后最差，IG3的預后最好（圖1B）。多變量Cox分析進一步驗證了免疫亞群是一個顯著的獨立預后因素(圖1C）。IG1有更多的腫瘤壞死和晚期腫瘤結節(jié)轉移（TNM）階段（圖1D）。值得注意的是，淋巴結轉移和血管侵襲在IG1中占優(yōu)勢，而內皮細胞在IG3中富集。在這個預后的TME特征中，IG1富含中性粒細胞脫顆粒和上皮-間質轉化（EMT）的通路，表明有炎癥和侵襲表型。相反，白細胞介導的細胞毒性和淋巴細胞介導的免疫通路在IG3中占主導地位，表明是一個免疫活性環(huán)境（圖1A）。RNA-seq數(shù)據(jù)的xCell分析顯示，IG1由髓系細胞如中性粒細胞和未成熟DC（iDC）主導，而IG3在適應性免疫細胞、自然殺傷（NK）細胞和活化DC（aDC）中含量豐富。IG2的免疫浸潤相對較低且不均勻，伴隨著基質細胞的稀少，這可能是腫瘤純度最高的原因（圖1D）。一般來說，中性粒細胞和iDC的豐富程度預示著生存率低，而淋巴細胞的積累，如CD4+T細胞、CD8+T效應/記憶（Tem）細胞和B細胞，與預后良好有關（圖1E）。事實上，TIL估計值與腫瘤純度呈負相關，與免疫反卷積呈正相關（圖1F）。同樣，TMA上的多重免疫染色證實，CD15、CD66b和CD1a的強度在IG1中最強，而CD3、CD8和CD20主要在IG3中表達（圖1G和H），與xCell估計明顯一致。
3個免疫亞群的分子特征不同
為了進一步說明患者亞組中的關鍵生物學過程，作者使用50個hallmark基因組進行了單樣本基因組富集分析（GSEA）。結合轉錄組學和蛋白質組學數(shù)據(jù)的通路富集分析顯示了免疫亞群之間不同的分子特征（圖2A）。IG1在炎癥反應、白細胞介素6（IL-6）/ JAK/ STAT3信號傳導和TNF-α/ NF-κB信號傳導中含量較高。IG2的特點是細胞周期轉錄程序（G2M檢查點、E2F靶點、Myc靶點）和DNA修復通路的富集，顯示了高增殖活性。IG3與糖酵解和缺氧通路的下調有關，也與氧化磷酸化（OXPHOS）通路的上調有關，這被強調為免疫激活的關鍵（圖2A）。作者進一步關注促癌和抑癌的炎癥。IG1富含原發(fā)性腫瘤炎癥細胞因子和趨化因子，包括IL-1A, IL-1B, IL-6, CXCL3, CXCL5和CCL18（圖2B）。大多數(shù)S100A家族成員的mRNA和蛋白水平，包括S100A8/A9，在IG1中被上調，這可能參與了癌癥促進炎癥的發(fā)生（圖2C）。同時，CD8A、GZMA和PRF1的mRNA和蛋白水平的增加證實了IG3中抑癌性炎癥的上調（圖2B）。此外，一組免疫特征共同顯示，相對于其他亞組，IG3顯示出升高的T細胞生存和T效應特征，而IG1則表現(xiàn)出升高的骨髓源性抑制細胞（MDSC）、M2/M1巨噬細胞、骨髓炎和促炎癥特征（圖2D）?？偟膩碚f，這種分層確定了兩個具有對抗性炎癥表型的免疫亞群。
最近，環(huán)氧化酶2（COX-2）/前列腺素E2（PGE2）軸被報道參與調節(jié)泛癌研究中的對抗性炎癥表型。作者發(fā)現(xiàn)編碼COX-2的PTGS2的轉錄水平在IG1中明顯上調（圖2B，E），COX-2 mRNA水平較高的患者預后較差（圖2F）。檢測到COX-2 mRNA水平與促癌因子包括IL-1A、IL-1B和IL-6之間存在強烈的正相關關系（圖2G）。中性粒細胞和iDCs的浸潤與COX-2 mRNA水平呈正相關，而漿細胞、CD4+T細胞和CD8+Tem細胞呈負相關（圖2H）。COX-2相關的炎癥特征（COX-IS）是多種癌癥對免疫檢查點抑制劑（ immune checkpoint inhibitors，ICI）反應的預測因子，COX-IS從IG1到IG3依次下降。此外，IG3具有最高的細胞溶解分數(shù)和免疫分數(shù)（圖H），進一步支持IG3可能更有可能對ICI作出反應的假設。
KRAS突變相關的髓系炎癥在IG1中占主導地位
我們進一步調查了可能與免疫學特征有關的基因組改變。IG2有更頻繁的體細胞拷貝數(shù)變異（SCNAs），SCNA負擔與免疫細胞浸潤負相關。當選擇亞型特異性突變基因時，作者發(fā)現(xiàn)IG1中近一半的腫瘤是KRAS突變者（圖3A，B）。KRAS突變與大多數(shù)xCell的適應性免疫和NK細胞特征呈負相關，但與iDC和中性粒細胞特征呈正相關（圖3C）。mRNA和蛋白水平的GSEA分析都確定中性粒細胞脫顆粒是與KRAS突變最密切相關的通路（圖3D）KRAS突變與一些炎癥分子，如COX-2、IL-1A、IL-1B、IL-6和S100A8/A9明顯正相關，類似于IG1的免疫學特征（圖3E）。有KRAS突變的腫瘤也顯示出骨髓炎癥、COX-IS和MDSC特征的升高，以及細胞溶解特征的降低（圖3F）。在Jusakul的隊列中，KRAS突變也導致了中性粒細胞浸潤、COX-2/S100A8表達和中性粒細胞脫顆粒通路的升高。考慮到PTGS2是IG1和KRAS突變腫瘤中與骨髓炎癥相關的最明顯的上調基因，作者假設KRAS突變可能上調COX-2產生PGE2，從而促進骨髓炎癥。Transwell試驗顯示，與KRASWT相比，KRASG12D的培養(yǎng)上清液明顯增強了中性粒細胞的遷移。KRASG12D培養(yǎng)液處理過的中性粒細胞顯示出更強的免疫抑制活性。接下來，作者使用致癌驅動產生了iCCA小鼠模型（KRASWT (AY) or KRASG12D (AYK)）。免疫組化證實，AYK腫瘤明顯浸潤著中性粒細胞（Ly6G、S100A8和S100A9陽性），而沒有CD8+T細胞和B細胞（圖3G，H）。scRNA-seq分析顯示，中性粒細胞和巨噬細胞在AYK腫瘤中的比例明顯較高，而T/NK細胞、B細胞和基質細胞在AY腫瘤中更為豐富，與多組學的結果一致（圖3I）。AYK腫瘤中的中性粒細胞顯示出更高的骨髓炎癥和炎癥標志物如S100a8、S100a9、Ptgs2和Il1b的表達升高，同時伴隨著T/NK細胞更強的衰竭表型（圖3J）。值得注意的是，KRAS突變使COX-2在腫瘤細胞和微環(huán)境中的表達上調（圖3G，H）。因此，中性粒細胞的過度浸潤可能是KRAS突變相關的骨髓炎癥的原因?？偟膩碚f，KRAS突變在顛覆抗腫瘤免疫和骨髓炎癥相關的免疫抑制方面具有關鍵作用。
抗原呈遞缺陷與IG2的免疫排斥相關
抗原呈遞的缺陷可能中斷新抗原的識別，導致腫瘤免疫逃避，而不考慮腫瘤突變負擔（TMB）。因此，作者在三個免疫亞群中探討了這些免疫逃逸途徑的潛在作用（圖4A）。盡管IG2的TMB和腫瘤新抗原負擔（TNB）相對較高，但通過人類白細胞抗原的雜合性缺失（HLA LOH）或抗原呈遞機制的其他成分的改變（APM），在IG2中經常觀察到抗原呈遞的缺陷（圖4A、B）。這樣的缺陷可能會阻礙新生T細胞的交叉刺激和隨后被刺激的T細胞對腫瘤的識別，這可能解釋了IG2中T細胞受體/B細胞受體（TCR/BCR）多樣性和RNA-seq reads映射到VDJ位點的減少。作者進一步計算了每個腫瘤的免疫編輯分數(shù)（immunoediting score），通過量化預測的HLA-I類結合新抗原的觀察數(shù)與預期數(shù)之比，分數(shù)<1表示存在免疫編輯。免疫編輯分數(shù)從IG1到IG3持續(xù)下降（圖4C）。在每個免疫亞組中，只有HLA LOH的IG2腫瘤的免疫編輯得分明顯較高，這表明IG2的腫瘤亞克隆可能容易出現(xiàn)HLA LOH相關的免疫規(guī)避（圖4D）?？傮w而言，15%（n=38）的患者表現(xiàn)出HLA LOH，與HLA完整的患者相比，其總生存期和無復發(fā)生存期呈下降趨勢（圖4E，F(xiàn)）。
免疫檢查點的表達可能反映了癌癥對活躍免疫系統(tǒng)的適應性免疫反應。作者發(fā)現(xiàn)這些分子的亞組特異性模式。HLA LOH與一些免疫檢查點分子相關，如程序性死亡配體1，并完善了TMB作為ICI的生物標志物。比較有HLA LOH和沒有HLA LOH的腫瘤的多組學特征，發(fā)現(xiàn)HLA LOH富含較高的TMB/TNB，較高的腫瘤純度，干擾素γ途徑減少，主要組織相容性復合體I類特征減少。同樣，在有HLA LOH的腫瘤中，T細胞生存和T效應特征也明顯減少。因此，盡管IG2的TMB相對較高，但APM缺陷，特別是HLA LOH，可能涉及免疫過敏和之后的免疫排斥（圖4G）。
三級淋巴結構（TLS）與IG3的抗腫瘤免疫相關
TLS為產生抗腫瘤免疫反應提供了一個關鍵的微環(huán)境。作者使用以前的TLS signature來估計TLS的分布，發(fā)現(xiàn)這些基因的mRNA水平，以及估計的TLS分數(shù)，在IG3中相對上調（圖5A，B）。病理檢查也證實，瘤內TLS在IG3中明顯累積（圖5C，D）。與那些只有聚合體（Agg）和沒有TLSs（TLSs-）的患者相比，既有初級卵泡（FL-I）又有次級卵泡（FL-II）的患者具有更高的估計TLS評分，證實了TLS評分的準確性（圖5E）。作者還發(fā)現(xiàn)瘤內TLSs預測的預后較好（圖5F-H），TLSs+（Agg、FL-I和FL-II）患者的特點是TNM分期早，沒有微血管侵襲，沒有肝內轉移，腫瘤體積小。多組學數(shù)據(jù)表明，TLSs+腫瘤顯示了G2M檢查點、炎癥反應和EMT等通路的特異性下調，而代謝和過氧化物酶體的通路上調。T細胞和B細胞以及共抑制物在TLSs+腫瘤中富集，表明有免疫激活的表型。此外，細胞溶解分數(shù)和COX-IS都預示著TLSs+iCCA患者對免疫療法有更好的反應。因此，IG3的免疫監(jiān)視可能部分歸因于瘤內TLSs（圖5I），這預示著該亞組對免疫治療有更好的反應。
HBV感染與iCCA髓系炎癥呈負相關
乙肝病毒（HBV）感染是眾所周知的iCCA的危險因素；然而，對HBV相關iCCA的免疫基因組學特征知之甚少。作者發(fā)現(xiàn)，HBV感染患者（n=68）在IG1中的代表性不足，與KRAS突變互斥，與TP53突變共存（圖6A）。HBV陽性的腫瘤顯示出細胞溶解評分升高，骨髓炎癥特征降低，COX-2 mRNA水平下降（圖6B）。最近的研究提出，ICI對HBV陽性肝細胞癌（HCC）患者顯示出療效，而不是非病毒性HCC。考慮到髓系炎癥對免疫療法的負面影響，COX-IS評分預測HBV陰性亞組對ICI的反應更差（圖6B）。HBV陽性iCCA患者的轉錄組與其他對ICIs有反應的實體瘤的表達譜相似（圖6C）。因此，在HBV陽性的iCCA中觀察到的骨髓炎癥的減少可能定義了一個可以從ICI中受益的人群。作者另外收集了5個HBV陽性和5個HBV陰性的iCCA的腫瘤和鄰近的非腫瘤組織進行scRNA-seq分析。在HBV陽性的腫瘤中觀察到T/B/NK細胞的比例增加，骨髓細胞的比例減少（圖6D），但HBV感染并不影響相鄰非腫瘤組織中每個集群的比例。接下來，作者對T/NK細胞和骨髓細胞進行了無監(jiān)督的聚類。在T/NK細胞內共出現(xiàn)了13個聚類（圖6E）。炎癥性CD4 T_CD15442的比例在IG1中明顯較高。CD4_SOCS343和NK_CD16044都在HBV陽性腫瘤中富集，這意味著HBV感染減輕了炎癥反應并增強了細胞溶解活性（圖6F）。髓系的重新聚類顯示了14個種群（圖6G）。值得注意的是，Macro_IL1B是HBV感染后比例下降最明顯的髓系群，其特點是IL1A、IL1B、IL6和TNF的完全高表達（圖6H）。COX-2 mRNA水平和促炎癥特征在Macro_IL1B中明顯高于其他骨髓細胞群，表明Macro_IL1B是骨髓炎癥的主要來源（圖6I）。來自HBV相關的iCCA的骨髓細胞顯示了炎癥通路的下調（圖6J）。與HBV陰性樣本相比，在HBV陽性樣本中觀察到的循環(huán)細胞的比例較小，反映出增殖能力相對下降（圖6H）?？偟膩碚f，HBV陽性患者擁有獨特的TME，CD4_SOCS3和NK_CD160群的比例增加，Macro_IL1B群和骨髓細胞增殖減少，這有助于抗腫瘤免疫。差異表達基因（DEG）分析顯示，HBV陽性腫瘤的巨噬細胞中下調最多的基因包括CCL13、TSC、FCGR2A、C1QA和C1QB。HBV陽性腫瘤中的NK細胞上調了幾個細胞溶解相關基因，如KLRC2、GZMK和CXCR6。在HBV陽性腫瘤中，巨噬細胞的特點是炎癥反應下調，而NK細胞中的細胞毒性和異體移植排斥反應上調（圖6K）。總之，iCCA中的HBV感染可能減輕骨髓炎癥，促進抗腫瘤免疫。因此，HBV感染與較長的總生存期略有關聯(lián)（圖6L）。
總結
這項研究旨在確定可用于個體化治療的iCCA免疫亞群的特征（圖7）。作者通過綜合多模態(tài)分析提供了對iCCA免疫景觀的全面了解。具有免疫和非免疫特征的三個免疫亞群可能對設計使用iCCA的新治療策略的臨床試驗有意義。
參考文獻
Lin J, Dai Y, Sang C, Song G, Xiang B, Zhang M, Dong L, Xia X, Ma J, Shen X, Ji S, Zhang S, Wang M, Fang H, Zhang X, Wang X, Zhang B, Zhou J, Fan J, Zhou H, Gao D, Gao Q. Multimodule characterization of immune subgroups in intrahepatic cholangiocarcinoma reveals distinct therapeutic vulnerabilities. J Immunother Cancer. 2022 Jul;10(7):e004892. doi: 10.1136/jitc-2022-004892
