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WES和RNAseq聯(lián)合分析晚期NSCLC患者免疫治療療效相關(guān)分子標(biāo)志物
一、研究背景
PD1/PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM-3等免疫檢查點(diǎn)抑制劑的開(kāi)發(fā)將癌癥治療領(lǐng)入全新的免疫治療時(shí)代，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞取得很好治療效果的同時(shí)，嚴(yán)重的治療副作用（irAEs）、只有20%的獲益人群比例和高昂的治療費(fèi)用，使得這種療法難以大范圍推廣。如何篩選獲益人群成為治療的首要問(wèn)題，很多分子標(biāo)志物已被證實(shí)可以有效預(yù)測(cè)ICIs療效，如PD-L1表達(dá)、TMB、TNB、發(fā)炎的腫瘤免疫微環(huán)境，特定癌種如結(jié)直腸癌中MSI不穩(wěn)定性檢測(cè)、MMR相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)等。
二、結(jié)論
來(lái)自Broad Institute的科研人員，對(duì)SU2C-MARK隊(duì)列393名經(jīng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑一線治療的晚期NSCLC患者，綜合進(jìn)行WES和RNAseq測(cè)序分析，結(jié)合臨床治療療效(完全緩解/部分緩解 or 穩(wěn)定 or 進(jìn)展)評(píng)估分組，全面解析與積極應(yīng)答和無(wú)反應(yīng)的差異療效相關(guān)分子標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，ATM變異顯示有較好的響應(yīng)率，而TERT擴(kuò)增跟無(wú)應(yīng)答相關(guān)；在轉(zhuǎn)錄組水平，免疫蛋白酶體的誘導(dǎo)組分(PSME1、PSME2、PSMB9)的表達(dá)與應(yīng)答之間具有顯著關(guān)聯(lián)；一種腫瘤內(nèi)在的去分化類型也顯示出較好的應(yīng)答率。
三、研究結(jié)果
1. 樣本信息
本次研究共收集來(lái)自9個(gè)癌癥研究中心共393名患者在免疫治療前的FFPE樣本，WES大多數(shù)采集的是腫瘤組織和配對(duì)血液對(duì)照，極少數(shù)采集的是癌旁組織對(duì)照，隊(duì)列中其中一個(gè)亞組(n=152)進(jìn)行了RNA測(cè)序。81%的患者經(jīng)過(guò)PD1/PD-L1單藥治療，17%聯(lián)合CTLA-4治療，1%聯(lián)合化療，最佳總體緩解（BOR）情況經(jīng)過(guò)專業(yè)的臨床影像學(xué)技術(shù)人員評(píng)估，并通過(guò)RECIST v1.1量化分組為CR/PR、SD和PD。
病理結(jié)果顯示，393名患者中，73%屬于肺腺癌，20%屬于肺鱗癌，2%為大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌肺癌和4%的其它組織類型。PD-L1免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，43%的患者缺乏PD-L1染色評(píng)估，成功染色的患者中25%的腫瘤比例評(píng)分（TPS）<1%，33%的TPS位于1%-49%，42%的患者PD-L1高表達(dá)，TPS>=50%。
2. 與療效相關(guān)基因組特征
首先對(duì)患者WES數(shù)據(jù)進(jìn)行全面的分子檢測(cè)，包括點(diǎn)突變、indel、focal CNV、亞克隆、突變特征、HLA分型與LOH、新生抗原、TCR/BCR等。結(jié)果顯示，TMB和主克隆突變負(fù)荷是最佳預(yù)測(cè)因子，另外TNB、新生抗原主克隆突變負(fù)荷、吸煙分子特征、特定indel分子特征對(duì)療效也具有預(yù)測(cè)作用，可綜合進(jìn)行考量。
點(diǎn)突變檢測(cè)結(jié)果顯示，常見(jiàn)肺癌驅(qū)動(dòng)基因變異均被檢出，如TP53、KRAS/STK11共突變、CDKN2A、EFGR、ATM等。不同臨床分組TMB差異明顯，CR/PR組14.0 mut/MB，SD組9.0 mut/MB,PD組7.4 mut/MB。對(duì)49個(gè)經(jīng)典的肺癌驅(qū)動(dòng)變異跟臨床分組進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，其中ATM突變具有顯著相關(guān)性（FDR q value=0.04,OR=3.5,95%CI=(1.5,8.0)），該結(jié)論在另外的MSK-IMPACT隊(duì)列中也得到了驗(yàn)證。接下來(lái)的相關(guān)變異是EGFR(q value=0.12,OR=0.29,95%CI(0.11,0.79))。
對(duì)focal CNV檢測(cè)結(jié)果同樣進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，5p15.33區(qū)帶拷貝數(shù)變異跟療效顯著相關(guān)(q value=0.07,OR=0.59,95%CI(0.40,0.87)，其中包含TERT基因。
免疫逃逸相關(guān)B2M loss、HLALOH導(dǎo)致的HLA雜合位點(diǎn)減少在本隊(duì)列中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)療效相關(guān)性，TCR burden具有相關(guān)性但不顯著。
圖1.WES分析結(jié)果
3. 與療效相關(guān)轉(zhuǎn)錄組特征
表達(dá)分析與免疫微環(huán)境
按CR/PR和SD/PD患者分組進(jìn)行差異表達(dá)分析，蛋白酶體誘導(dǎo)亞基PSME1、PSME2、PSMB9在CR/PR組中顯著高表達(dá)，它們編碼不同的蛋白酶體組分，受INFγ和TNF調(diào)控，可增強(qiáng)短肽的抗原呈遞作用，從而提高響應(yīng)率。同樣高表達(dá)的還有炎性趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11及其淋巴細(xì)胞受體。β-catenin代謝通路相互作用轉(zhuǎn)錄因子AUTS2和TCF7L1、NK-kB通路負(fù)調(diào)節(jié)基因PDLIM3在SD/PD組顯著高表達(dá)，跟免疫無(wú)應(yīng)答有關(guān)。對(duì)Hallmark Gene Sets的 GSEA結(jié)果顯示，較好應(yīng)答與同種異體排斥、INFγ、DNA修復(fù)相關(guān)基因集顯著富集有關(guān)，而EMT、Wntβ-catenin信號(hào)通路、TGF-β通路基因富集跟耐藥有關(guān)。
使用先前鑒定的單細(xì)胞亞群表達(dá)特征，在RNAseq數(shù)據(jù)集上進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞耗竭跟應(yīng)答強(qiáng)相關(guān)，而單核/巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞跟抗性強(qiáng)相關(guān)。另外使用已有的人和小鼠肺癌中浸潤(rùn)性骨髓細(xì)胞單細(xì)胞數(shù)據(jù)結(jié)果，在本隊(duì)列中將hMono 3和hN 3亞型鑒定為與對(duì)檢查點(diǎn)阻斷的抗性特別相關(guān)。
圖2. 轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析結(jié)果
NMF矩陣分解
對(duì)770個(gè)顯著差異表達(dá)基因在患者中的表達(dá)矩陣進(jìn)行B-NMF矩陣分解，得到3個(gè)不同的分子亞型M1、M2、M3，都代表包含免疫細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)表達(dá)的微環(huán)境綜合特征。對(duì)三種不同的分子特征進(jìn)行GSEA分析，發(fā)現(xiàn)M1跟EMT（傷口愈合和纖維化基因集）有關(guān)，M2跟同種異體排斥和IFNγ有關(guān)，M3跟細(xì)胞周期相關(guān)E2F靶點(diǎn)弱相關(guān)，可能反映了增殖性腫瘤特征，最類似之前報(bào)道的免疫沙漠表型，M2中應(yīng)答率相比M1和M3有所增加，跟單細(xì)胞表達(dá)特征結(jié)論一致。
圖3.NMF矩陣分解
腫瘤內(nèi)在亞型(TI subytpe)
收集來(lái)自TCGA-LCNE具有明確病理分型的1000多名NSCLC患者的RNAseq數(shù)據(jù)，構(gòu)建免疫應(yīng)答顯著相關(guān)基因以及免疫細(xì)胞和基質(zhì)成分相關(guān)基因的表達(dá)矩陣，B-NMF將隊(duì)列劃分為明確的4個(gè)亞簇，其中TI-1和TI-2主要包含腺癌，TI-3主要包含鱗癌，TI-4代表大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌。肺腺癌和肺鱗癌表達(dá)標(biāo)志物NAPSA和TP63在分化良好的TI-2和TI-3中具有預(yù)期的譜系標(biāo)記偏好，而在TI-1中均弱表達(dá)，肺譜系標(biāo)志物的表達(dá)降低先前已在低分化腺癌的亞型中描述，低分化的TI-1中富集內(nèi)胚層譜系標(biāo)志物基因，如腸道譜系免疫組化標(biāo)志物TFF1、FGA、CPS1的高表達(dá)。去分化的TI-I簇與應(yīng)答最密切相關(guān)，這與該亞型中升高的突變負(fù)荷以及其與M2(免疫活化亞型)的更強(qiáng)相關(guān)性一致。
圖4.肺癌病理亞型相關(guān)基因表達(dá)
4. WES和RNA分子特征綜合分析
結(jié)合以上來(lái)自WES和RNA的多個(gè)最佳預(yù)測(cè)特征，通過(guò)相關(guān)性矩陣發(fā)現(xiàn)3個(gè)強(qiáng)相關(guān)模塊,C1、C2和C3，且每個(gè)子模塊內(nèi)部特征具有一致的響應(yīng)關(guān)聯(lián)。C1反映典型的“傷口愈合”微環(huán)境，包括免疫抑制性骨髓和基質(zhì)特征，C2反映與“免疫活化/耗竭”相關(guān)的更經(jīng)典的細(xì)胞因子和免疫環(huán)境，包括浸潤(rùn)性免疫特征和蛋白酶體亞基，C3由與突變負(fù)荷相關(guān)的特征組成，代表新抗原豐度和增強(qiáng)的免疫識(shí)別，C4包含一些弱相關(guān)的分子特征，包括EGFR突變，但與中度突變負(fù)荷特征負(fù)相關(guān)，表明該亞型的內(nèi)在抗性可能主要由較低的新抗原負(fù)荷相關(guān)。其中免疫活化/耗竭和傷口愈合簇相關(guān)特征的評(píng)估可增強(qiáng)患者PFS相關(guān)預(yù)測(cè)能力。
圖5. WES和RNAseq預(yù)測(cè)因子相關(guān)性矩陣
5. 單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析
對(duì)已發(fā)表的NSCLC單細(xì)胞RNA數(shù)據(jù)的綜合細(xì)胞亞群分類結(jié)果，跟WES和RNAseq結(jié)合最佳預(yù)測(cè)因子特征進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)cluster12對(duì)TI-1中去分化肺腺癌亞群的重現(xiàn)，TI-1中代表傷口愈合和免疫激活/耗竭分子特征相關(guān)的EMT和TGF-β主要反映成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，而不是間充質(zhì)細(xì)胞，負(fù)預(yù)測(cè)因子AUTS2和TCF7L1在腫瘤內(nèi)低表達(dá)，蛋白酶體在大部分細(xì)胞中表達(dá)，炎性趨化因子CXCL9可能來(lái)自于髓系細(xì)胞，CXCL11可能來(lái)自于內(nèi)皮細(xì)胞。低分化TI-1跟M2特征雖然具有強(qiáng)相關(guān)性，但在單細(xì)胞分析結(jié)果中顯示包含不同的細(xì)胞亞群，提示我們較大的相互關(guān)聯(lián)塊在單細(xì)胞中并不總是代表相同的細(xì)胞來(lái)源。
圖6. 單細(xì)胞分析結(jié)果
6. 總結(jié)
本文首次對(duì)將近400例NSCLC患者免疫治療相關(guān)生物標(biāo)志物進(jìn)行全方面分析，深入剖析免疫檢查點(diǎn)抑制劑響應(yīng)與耐藥分子機(jī)制。包括基因組水平變異（ATM突變、TERT擴(kuò)增）、轉(zhuǎn)錄組水平表達(dá)（蛋白酶體誘導(dǎo)組分基因）、微環(huán)境分子特征(M1：傷口愈合，EMT和TGF-β基因富集；M2：免疫活化；M3：免疫沙漠)、肺癌病例亞型分子特征（TI-1：去分化肺腺癌，TI-2主要包含腺癌，TI-3主要包含鱗癌，TI-4代表大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌），以及對(duì)所有預(yù)測(cè)因子根據(jù)相關(guān)性聚合成C1、C2、C3、C4模塊，同時(shí)在肺癌單細(xì)胞RNA數(shù)據(jù)中深入發(fā)現(xiàn)以上關(guān)聯(lián)塊所代表的細(xì)胞亞群。
