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Defining HPV-specific B cell responses in
patients with head and neck cancer
頭頸癌患者中鑒定出HPV-特異性B細(xì)胞反應(yīng)
2020年11月發(fā)表在Nature（IF: 49.962）上的文章。本研究從43名患者身上切除的頭頸部腫瘤樣本，在HPV陽性的頭頸癌患者的樣本中檢測到HPV特異性B細(xì)胞反應(yīng)，并且原位檢測到HPV特異性IgG抗體，同時觀察到類似于生發(fā)中心的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)類似于淋巴結(jié)中的用于在免疫反應(yīng)期間對B細(xì)胞進(jìn)行“訓(xùn)練”的生發(fā)中心。
摘要:
腫瘤通常含有B細(xì)胞和漿細(xì)胞，但這些瘤內(nèi)B細(xì)胞的抗原特異性尚不清楚。在HPV陽性的頭頸部癌癥患者的樣本中檢測到特異性B細(xì)胞反應(yīng)，其活躍地產(chǎn)生hpv特異性IgG原位抗體。在腫瘤微環(huán)境中存在hpv特異性抗體分泌細(xì)胞(antibody secreting cells-ASCs)，感染的細(xì)胞很少會出現(xiàn)該旁觀者招募的現(xiàn)象，暗示HPV感染導(dǎo)致B細(xì)胞存在局部和抗原特異性的ASC反應(yīng)。人乳頭瘤病毒特異性ASC反應(yīng)與血漿IgG滴度相關(guān)，直接針對人乳頭瘤病毒E2、E6和E7蛋白，其中對E2的反應(yīng)最為顯著。利用瘤內(nèi)B細(xì)胞和漿細(xì)胞，我們生成了幾種hpv特異性的人單克隆抗體，這些抗體表現(xiàn)出高度的體細(xì)胞高突變，與慢性抗原暴露一致。單細(xì)胞RNA測序分析檢測到腫瘤微環(huán)境中激活的B細(xì)胞、生發(fā)中心B細(xì)胞和ASCs。與腫瘤實質(zhì)相比，B細(xì)胞和ASCs優(yōu)先定位于腫瘤間質(zhì)，并有形成良好的激活簇。
B細(xì)胞表明正在進(jìn)行的生發(fā)中樞反應(yīng)?？偟膩碚f，我們發(fā)現(xiàn)在腫瘤微環(huán)境中可以發(fā)現(xiàn)抗原特異性激活和生發(fā)中心B細(xì)胞以及漿細(xì)胞。該發(fā)現(xiàn)能夠幫助人們更好理解人類癌癥中體液免疫反應(yīng)，并暗示腫瘤浸潤的B細(xì)胞可以用于開發(fā)治療藥物。
腫瘤微環(huán)境(TME)中存在hpv特異性抗體分泌細(xì)胞
我們獲得了手術(shù)切除的表達(dá)p16的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌樣本，p16是一種廣泛使用的HPV狀態(tài)的替代標(biāo)記物，特別是在口咽鱗癌中。我們使用基因組來確認(rèn)HPV狀態(tài)，在43例頸部鱗狀細(xì)胞癌患者中選取32例p16+患者，并從福爾馬林固定石蠟包埋切片中分離DNA。32份樣本中有31份檢測出HPV DNA，大多數(shù)病例(84.4%)檢測出HPV type 16陽性。接著對來自浸潤在原發(fā)腫瘤的淋巴細(xì)胞(TILs)和來自p16+頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)患者內(nèi)的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)(metLNs)和外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)進(jìn)行抗體分泌細(xì)胞(ASCs)量化。與外周學(xué)血相比，metLNs和TILs顯示ASCs明顯富集。metLNs和TILs中的ASCs主要產(chǎn)生IgG，其次是IgA和IgM, 分泌IgG+的ASCs占淋巴細(xì)胞總數(shù)的0.11% ~ 3.8%。相比之下，p16+ HNSCC患者外周血中的ASCs的頻率較低，表現(xiàn)出不同的同型分布(IgA≥IgG>IgM)，在頻率和同型分布上 與健康個體外周血ASCs相當(dāng)。
接下來試圖尋找TME中的ASCs是否產(chǎn)生針對HPV抗原產(chǎn)生特異性抗體。
進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，metLNs(轉(zhuǎn)移性腫瘤淋巴結(jié))和TILs(腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞)中IgG+ ASCs能夠產(chǎn)生HPV蛋白E2、E6、E7的特異性抗體，且E2特異性抗體反應(yīng)占據(jù)大部分(圖1,a-c)
圖 1 HPV陽性HNSCC患者TME中存在HPV特異性抗體分泌細(xì)胞
a表示酶聯(lián)免疫吸附點(ELISPOT)顯示TILs中分泌E2、E6和E7特異性IgG+的ASCs。b, c,表示分泌E2、E6、E7特異性IgG+的ASCs,metLNs (n = 38) (b)和TILs (n = 23) (c)。紅色點表示無任何反應(yīng)的患者。
與之前的報道一致，與p16+腫瘤相比，p16- HNSCC腫瘤lym細(xì)胞浸潤明顯減少，ASCs總量差不多，但缺乏hpv特異性IgG+ ASCs。p16- HNSCC患者相對于p16+ HNSCC患者缺少HPV特異的IgG+記憶B細(xì)胞。(圖1d)
接下來，我們比較了14例p16+患者TME中流感和HPV特異性ASCs 的數(shù)量，在TME中的 ASCs簡單地反映了炎癥驅(qū)動的循環(huán)招募和分化。雖然流感特異性MBCs在外周血中明顯較高，但HPV特異性ASCs在TME中占主導(dǎo)地位 (圖1d )。這些數(shù)據(jù)表明，表明HPV特異性IgG抗體在TME中是積極產(chǎn)生的，E2蛋白是體液免疫反應(yīng)的主要靶點。
ASC與HPV抗體的相關(guān)性
腫瘤微環(huán)境（TME）存在hpv特異性IgG+中的ASCs促使我們在隊列中調(diào)查HPV E2、E6和E7的血清學(xué)反應(yīng)。血漿中抗E2、E6、E7的IgG抗體滴度可以明確區(qū)分p16+患者HNSCC(n = 39)從p16- HNSCC(n = 10)（圖2a）。在一組患者中，對HPV E抗原的血漿IgG反應(yīng)主要由IgG1組成，其次是高度不同水平的IgG3(圖2b)。值得注意的是，HPV特異性IgG滴度與在metLNs和TILs中的ASCs的IgG滴度相關(guān)（圖2c）。
圖 2
生成HPV特異性人類抗體
之前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了抗原特異性B細(xì)胞的一個子集，稱為“激活B細(xì)胞”(ABCs)，這是一種增殖細(xì)胞，與ASCs不同，屬于MBC譜系，在接種或感染后存在于外周血。接下來想要探究TME中是否存在hpv特異性的abc，是否可以用于產(chǎn)生hpv特異性的人類單克隆抗體。我們使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)和熒光標(biāo)記的E2蛋白純化hpv特異性ABCs(CD19+
IgD?CD20+CD71+)（圖3a）。14個成功產(chǎn)生的抗體中有12個(約86%)被識別E2在酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)中的應(yīng)用（圖3b）。E2特異性單克隆抗體在重(Vh)鏈和輕(Vl)鏈的可變區(qū)表現(xiàn)出高度的體細(xì)胞高突變(SHM)，三個克隆譜系分別由兩個克隆表示(圖3c)。此外，在hpv特異性抗體中“激活B細(xì)胞”(ABCs)和高度SHM的存在表明這些腫瘤相關(guān)病毒抗原與長期和持續(xù)的體液免疫反應(yīng)相關(guān)。
圖 3（點的顏色表示對應(yīng)的抗體）
腫瘤微環(huán)境(TME)中B細(xì)胞的scRNA-seq分析
從三個HPV+HNSCC患者的metLNs和TILs中獲得B細(xì)胞系活化細(xì)胞(CD19 +IgD?CD71 +)，并用無監(jiān)督方法進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)分析（圖4a）。此外，我們從接種季節(jié)性流感病毒疫苗7天后的健康參與者外周血中分離出活化的細(xì)胞?？偣灿?271個單細(xì)胞鑒定出4個簇(圖4b,c)。在基因表達(dá)譜和基因集富集分析的基礎(chǔ)上，我們將細(xì)胞簇命名為ABCs、ASCs、生發(fā)中心B細(xì)胞(GCBs)和過渡細(xì)胞(transitory cells)，這些細(xì)胞簇表現(xiàn)出ASCs、GCBs和增殖基因集富集的雜交表型。總的來說，在所有的細(xì)胞簇中都發(fā)現(xiàn)了來自metLNs和TILs的激活細(xì)胞，盡管患者之間的分布差異很大（圖4d）。相比之下，在季節(jié)性流感疫苗接種7天后，從PBMCs中提取的激活細(xì)胞在GCB集群中未被檢測到，在臨時細(xì)胞集群中幾乎不存在。
圖 4
B細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄組
接著，我們進(jìn)行了RNA-seq分析，以確定三種主要B細(xì)胞亞群之間的轉(zhuǎn)錄差異(ASCs，ABCs和GCBs)。我們用流式細(xì)胞
從兩個HPV+ HNSCC患者的metLNs和TILs進(jìn)行純化（圖5a），ASCs (CD19+ CD20? IgD? CD38hiCD71+ ), ABCs (CD19+ CD20+ IgD? CD71+ CD10? )，GCBs (CD10+ ABCs)。此外，我們分析了在接種季節(jié)性流感疫苗后第7天從健康受試者外周血中分離的ASCs和ABC。為了更廣泛地描述轉(zhuǎn)錄景觀，我們首先進(jìn)行了主成分分析，確定了兩個主成分(PC)，它們共同解釋了大約60%的觀測到的轉(zhuǎn)錄變異（圖5b）。PC1占轉(zhuǎn)錄變異的41%，能清晰區(qū)分ASCs、ABC和GCB，還能從血液ABC中分離出組織。通過k-means聚類對單個基因進(jìn)行基因表達(dá)分析，確定了6個基因簇，根據(jù)分類的子集以及樣本來源(血液和組織)來區(qū)分樣本(圖5c)。ASC的特征是表達(dá)增加常見的ASC相關(guān)基因如XBP1、MZB1、CD27和CD38的，而B細(xì)胞譜系是表達(dá)降低的基因如MS4A1、IRF8和CD24的。腫瘤來源的ASCs顯示額外的漿細(xì)胞相關(guān)基因如PRDM1, SDC1的表達(dá)增加。與這些數(shù)據(jù)一致，大部分ASCs在TME(n = 14)不表達(dá)Ki67，這表明腫瘤相關(guān)ASCs更像漿細(xì)胞表型。GCB表達(dá)高水平的BCL6, AICDA, MME和S1PR2。值得注意的是，來自外周血的流感特異性細(xì)胞不同于腫瘤來源的細(xì)胞，它們高表達(dá)參與細(xì)胞遷移的基因，如CD52、S1PR4和ITGA3。
圖 5
B細(xì)胞瘤內(nèi)定位
接著，我們開始研究B細(xì)胞和ASCs在7例HPV +頭頸部鱗狀細(xì)胞癌定位（圖5d）?？侭細(xì)胞(CD19+CD20 +)和ASCs (CD19+
CD20?IRF4 +)在基質(zhì)中比p16+腫瘤更為普遍（圖5e）。激活B細(xì)胞(CD19+CD20+Ki67+)傾向于在間質(zhì)中以更高的密度存在，在腫瘤間質(zhì)中有形成良好的ABC簇，表明生發(fā)中心反應(yīng)(圖5e)。TME中ASCs主要為Ki67?但CD138的表達(dá)差異很大，提示漿細(xì)胞分化的不同階段。
總的來說，我們的數(shù)據(jù)顯示，在TME中存在幾種不同的抗原特異性B細(xì)胞亞群，包括ABC、GCBs、最近生成的漿細(xì)胞和處于不同分化階段的漿細(xì)胞。
方法
樣品的采集、制備和儲存
接受手術(shù)的HNSCC患者是根據(jù)經(jīng)批準(zhǔn)的Emory大學(xué)機(jī)構(gòu)審查委員會協(xié)議(WINSHIP4008-17)招募，所有患者都提供知情同 意。所有患者在手術(shù)時都曾有未經(jīng)治療的局部晚期疾病，表 現(xiàn)為局部轉(zhuǎn)移性淋巴。組織樣品被切成小塊，分離淋巴細(xì)胞。 在手術(shù)時在檸檬酸鈉CPT細(xì)胞制備管(BD)中采集外周血樣本，并立即處理以獲得PBMCs和血漿。對照樣本來自健康的個人。
流式細(xì)胞
用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選。
抗原
重組HPV抗原與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)融合在大腸桿菌中表達(dá)。
編碼 HPV16E2(UniprotP03120) ，HPV16E6(UniprotP03126)和HPV16E7的DNA序列 從合成的 E2-E6-E7基因結(jié)構(gòu) (Genscript)中擴(kuò)增Uniprot P03129。采用2018-2019年或2019-2020年季節(jié)的四價滅活季節(jié)性流感疫苗Fluarix(GSK)來評估流感特異性反應(yīng)。
ELISA和ELISPOT
ELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。
ELISPOT是用于在單細(xì)胞水平檢測細(xì)胞因子(CK)分泌細(xì)胞和抗體分泌細(xì)胞(ASC)的一項細(xì)胞免疫學(xué)檢測技術(shù)。通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下或通過儀器對斑點進(jìn)行計數(shù)，1個斑點代表1個細(xì)胞，從而計算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。（詳細(xì)流程請參考原文）
免疫印跡
通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。（詳細(xì)流程請參考原文）
HPV分型
用BLAST對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、測序和分析。（詳細(xì)流程請參考原文）
抗體制備
asc (CD3/14/16?CD19 +CD20?IgD?CD38hiCD71 +)或E2特異性激活的B細(xì)胞(CD3/14/16?CD19+CD20+IgD?CD71+MBP-E2 +)的單細(xì)胞分選到96孔板含有細(xì)胞裂解緩沖液。如前所述進(jìn)行IgG重鏈和輕鏈基因的克隆，并進(jìn)行少量修飾。
通過IgBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析V(D)J的使用情況和對克隆的單克隆抗體進(jìn)行SHM序列分析。
多重免疫組化和圖像分析
采用OPAL Polaris系統(tǒng)(Akoya Biosciences)進(jìn)行七色多重免疫組化。使用Vectra Polaris多光譜成像系統(tǒng)對染色玻片進(jìn)行成像和掃描。高分辨率全片掃描圖像的隨機(jī)腫瘤區(qū)域(包括腫瘤實質(zhì)和基質(zhì))首先在PhenoChart 1.0.12 (Akoya Biosciences)中注釋，然后使用inForm2.4.8軟件(Akoya Biosciences)進(jìn)行分析。使用DAPI和P16作為腫瘤的標(biāo)記物來識別腫瘤實質(zhì)和間質(zhì)區(qū)域。對于HPV陰性腫瘤，CD138被用作腫瘤的替代標(biāo)記物。基于核DAPI和膜質(zhì)CD20完成自適應(yīng)細(xì)胞分割。從感興趣的免疫細(xì)胞表型中，至少有25個細(xì)胞被手工選擇，并用于訓(xùn)練軟件進(jìn)行自動分析。數(shù)據(jù)R包phenoptr (v.0.2.5) 和phenoptrReports (v.0.2.6)進(jìn)行處理(Akoya Biosciences)。
scRNA-seq分析
使用Cell Ranger v3.1進(jìn)行比對、過濾、條形碼計數(shù)和唯一分子標(biāo)識符計數(shù)。使用Seurat v.3.1.4對數(shù)據(jù)進(jìn)行更深一步的分析。所有單細(xì)胞分析使用R .3.6.2進(jìn)行。簡言之，包括線粒體基因百分比低于0.07%的細(xì)胞。檢測到的基因超過6000個或少于1000個的細(xì)胞被認(rèn)為是異常細(xì)胞，并被排除在下游分析之外。使用Seurat函數(shù)“FindIntegration Markers”將來自不同患者的樣本合并，該函數(shù)識別并計算數(shù)據(jù)集對之間的錨，以減少樣本批處理效果。由于免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)錄本構(gòu)成ASC/GC簇的轉(zhuǎn)錄組的大部分，因此除另有說明外，免疫球蛋白基因被排除在分析之外。原始唯一分子標(biāo)識計數(shù)歸一化到每百萬總計數(shù)和對數(shù)轉(zhuǎn)換的唯一分子標(biāo)識計數(shù)。根據(jù)平均表達(dá)和離散度選擇可變基因。進(jìn)行主成分分析，使用統(tǒng)計最顯著的前6個主成分進(jìn)行UMAP分析?；谥鞒煞址治鼍S度生成聚類和UMAP圖。每個聚類內(nèi)差異表達(dá)的標(biāo)記基因由Seurat函數(shù)“FindAllMarkers”鑒定，平均對數(shù)倍變化截斷值為0.5。將前10個標(biāo)記基因的比例表達(dá)數(shù)據(jù)制作熱圖。歸一化數(shù)據(jù)以特征圖或小提琴圖的形式表示?；蚣u分使用VISION R軟件包v.2.1.0，按照前面描述的評分算法進(jìn)行。簡而言之，特征基因的表達(dá)是基于從最近鄰處計算出的預(yù)測退出概率進(jìn)行加權(quán)，并對基因集中所有基因進(jìn)行歸一化求和。ABC和ASC基因集已在前面描述過。用VISION包計算每個群體的簽名分?jǐn)?shù)并轉(zhuǎn)換為二進(jìn)制數(shù)字向量，并對具有Yates連續(xù)性校正的二進(jìn)制變量進(jìn)行Pearson 卡方檢驗，以確定統(tǒng)計意義。采用Bonferroni校正對P值進(jìn)行調(diào)整，P值 <0.05表示顯著。
RNA-seq分析
使用HISAT2將基因序列與人類基因組進(jìn)行了比對(GRCh38;通過Ensembl訪問)。用samtools匹配并進(jìn)行排序和索引，使用featurecots函數(shù)對齊匹配到Ensembl參考轉(zhuǎn)錄組的reads。使用DESeq2進(jìn)行庫大小的歸一化、對數(shù)轉(zhuǎn)換和差異表達(dá)分析。使用FactoMiner R軟件包對對數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。采用R中的k-means函數(shù)進(jìn)行k-means聚類，聚類數(shù)量通過共識聚類確定。用ggplot2 R軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。
統(tǒng)計分析
在小提琴圖中，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，或中位數(shù)和四分位數(shù)表示。多組比較采用Friedman檢驗和雙側(cè)Dunn多重比較檢驗。雙尾采用Mann-Whitney方法比較HNSCC p16? 和p16+患者的hpv特異性IgG抗體滴度和。采用配對雙尾t檢驗比較ASCs在PBMCs和組織中的Ki67表達(dá)。在相關(guān)分析中，進(jìn)行了 Spearman相關(guān)，并提供了r和雙尾P值。雙向重復(fù)測量采用方差分析和Sidak多重比較檢驗比較不同B細(xì)胞亞群在TME中的分布情況。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。所有統(tǒng)計分析均使用GraphPad Prism v.8.3進(jìn)行。沒有使用統(tǒng)計學(xué)方法來預(yù)先確定樣本量。實驗不是隨機(jī)的，研究人員在實驗和結(jié)果評估過程中對分配也不是盲目的。
總結(jié)：
hpv特異性抗體在hpv相關(guān)癌癥中的作用尚不清楚。然而，兩項研究表明，HPV特異性抗體滴度的增加與HPV+患者生存率的提高和復(fù)發(fā)風(fēng)險的降低有關(guān)。數(shù)據(jù)顯示，TME中hpv特異性抗體滴度與ASCs之間存在明顯的相關(guān)性。因此，我們很容易推測，TME中hpv特異性ASCs的存在可能也與改善臨床結(jié)果有關(guān)。然而，需要進(jìn)一步的研究來解決是否增加通過HPV-specific抗體提高患者生存率。
