泛癌單細(xì)胞分析癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性和可塑性

大家好呀，今天小編給大家?guī)淼氖潜驹伦钚掳l(fā)表在nature communications上的一篇文獻(xiàn)，題目是“Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment”（IF：17.694）。

癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)是腫瘤微環(huán)境(TME)的主要成分，影響腫瘤標(biāo)志物，但尚未對其在不同癌癥類型中的普遍特征進(jìn)行系統(tǒng)研究。作者對10種實(shí)體瘤的226個樣本進(jìn)行泛癌分析，以單細(xì)胞分辨率描述TME，說明異質(zhì)性CAF的共性/可塑性。

主要結(jié)果：

• 主要CAF類型的激活軌跡分為三種狀態(tài)，與其他細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的相互作用，并與免疫治療的預(yù)后有關(guān)。次要的CAF類型來源于其他TME成分(如內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞) 。
• 廣泛存在的內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變CAF，可能與SPP1⁺腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞相互作用，與內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變和生存分層有關(guān)。

背景：

TME中存在不同類型的非惡性細(xì)胞，主要包括成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。以前的研究已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了TME在癌癥中不可或缺的作用，如腫瘤進(jìn)展、治療耐藥、血管生成誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)移。從機(jī)制上講，TME通過復(fù)雜和動態(tài)的途徑調(diào)節(jié)與癌癥相關(guān)的信號，涉及配體-受體相互作用、細(xì)胞因子/代謝物反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)沉積。

由于不同癌癥類型患者的TME細(xì)胞相似，最近進(jìn)行了一些基于scRNA-seq的泛癌研究，這些泛癌研究只關(guān)注免疫細(xì)胞的特性，而忽略了不同細(xì)胞成分之間的相互作用。

結(jié)果：

Results1：Landscape of the TME in pan-cancer illustrated using scRNA-seq analysis

非監(jiān)督聚類產(chǎn)生了總共34個與TME相關(guān)的簇。根據(jù)不同細(xì)胞類型的marker，這些簇被分為五個主要細(xì)胞成分，包括成纖維細(xì)胞(c1-c8，DCN，COL1A1)，淋巴細(xì)胞(c9-c17，CD3D，CD3E)，髓系細(xì)胞(c18-c24，CD68，CD14)，內(nèi)皮細(xì)胞(c25-c28，VWF，PECAM1)和漿細(xì)胞(c29-c34，IGHG1，JCHAIN)。其余的細(xì)胞聚集為上皮細(xì)胞(EpCAM，KRT19)（圖1 a-c）。

與上皮癌細(xì)胞的組織類型特異性分布相比，不論癌癥類型還是組織類型，TME均無明顯偏倚。雖然五種TME組分在正常組織、鄰近組織和腫瘤組織中分布相對均勻，但來自癌癥/鄰近組織的細(xì)胞主要集中在特定的簇中(例如，c2和c9)，反之亦然(例如，c3)（圖1 d-e）。

C20(FABP4+巨噬細(xì)胞)，顯示出癌癥類型的豐富。與鄰近對照、早期和晚期原發(fā)腫瘤以及肺癌腦轉(zhuǎn)移相比較FABP4+巨噬細(xì)胞(c20)的比例逐步下降，提示FABP4+巨噬細(xì)胞可能與肺癌進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。APOE+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM, c19)的異質(zhì)性通過C1QC+和SPP1+細(xì)胞的互補(bǔ)分布表現(xiàn)出來。在不同腫瘤類型中，SPP1+ TAMs的比例從正常到鄰近/腫瘤樣本顯著增加，而SPP1-TAMs的比例不顯著增加，提示SPP1+ TAMs在腫瘤發(fā)生和代謝中的潛在作用。 （圖1 f-i）

腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞(TECs)和正常內(nèi)皮細(xì)胞(NECs)的不同轉(zhuǎn)錄譜，包括TEC顯著上調(diào)胰島素反應(yīng)相關(guān)基因(IGFBPs和INSR)、MAPK調(diào)控基因(如SPRY1)和免疫球蛋白(如CD320和IGHG4) ，這表明TECs可能在血管生成、腫瘤生長和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。（圖1 j）

Results2：Generalized activation of CAFs in the TME

CellphoneDB評估每個主要TME組分與上皮細(xì)胞之間的相互作用?？傮w交互作用按正常、鄰近和腫瘤的順序顯著增加。成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和髓系細(xì)胞之間的串?dāng)_在TME中占主導(dǎo)地位。腫瘤/鄰近樣本中，成纖維細(xì)胞與其他TME組分的串?dāng)_最頻繁，成纖維細(xì)胞可能通過與其他TME組分相互作用，在癌癥生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。（圖2 a-c）

通過分別過度表達(dá)ACTA2、FAP/TGFB1和CFD，將三個數(shù)量占主導(dǎo)地位的主要成分(即c1、c2和c4)定義為癌癥相關(guān)肌成纖維細(xì)胞(CAFmyo)、炎性CAF(CAFinfla)和脂肪源性CAF(CAFadi)。

其他三個次要成分(即C6-C8)被鑒定為內(nèi)皮細(xì)胞到間充質(zhì)轉(zhuǎn)化CAF(CAFEndMT)、外周神經(jīng)樣CAF(CAFPN)和抗原提呈CAF(CAFap)。SCENIC分析確定了CAFmyo、CAFinfla和CAFadi中可能存在的調(diào)節(jié)子。（圖2 d,e）

通過進(jìn)化軌跡揭示了從NFS到CAF的兩條不同的激活路徑，增強(qiáng)了三種不同狀態(tài)的定義，CAFstate1(NFS)、CAFstate2(CAFmyo)和CAFstate3(CAFadi/CAFinfla)。EMT評分沿著CAF的激活軌跡逐漸增加，且CAFstate3顯著高于CAFstate1/2，提示在CAF激活過程中存在一個普遍的去分化過程。CAFstate2傾向于在血管生成中發(fā)揮作用，而CAFstate3同時高表達(dá)促血管生成基因和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因。（圖2 f-h）

Results3：Interactions of CAFs with TME and epithelia

CAF_state3與NK/T亞簇之間的相互作用高于CAF_state1和CAF_state2。除了獲得性免疫外，CAF還可能調(diào)節(jié)先天性免疫細(xì)胞。TAM與CAF_Status3存在較多的受體配體對，而肥大細(xì)胞幾乎不與CAF相互作用。TECs與CAF_state2/3之間的相互作用比較強(qiáng)烈（圖3 a-f）

CAFstate3與免疫細(xì)胞之間的聯(lián)系最為緊密，CAF狀態(tài)可能在檢查點(diǎn)阻斷免疫治療中發(fā)揮重要作用。基于ssGSEA，使用三個獨(dú)立免疫治療數(shù)據(jù)的患者的bulk數(shù)據(jù)來估計(jì)每個State CAF的比例。CAFstate3的高比例與較差的總體生存率顯著相關(guān)，提示CAFstate3在免疫治療中具有潛在的獨(dú)立預(yù)后價值。（圖3 g）

Results4：Characterization of the plasticity of fibroblasts via pan-cancer analysis

CAF_ap高表達(dá)ACTA2、HLA-DRA和CD74。CAF_ap與腫瘤浸潤性T細(xì)胞的相互作用明顯多于CAF_myo。

CAF_ap可能是CAFs和TAMs之間的過渡位置。偽時序分析，顯示了一條可能的進(jìn)化TAM-CAFap-CAFmyo路徑。過共聚焦mif成像在甲狀腺癌的間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了少量共表達(dá)α-sma和CD163的細(xì)胞。CAF(Mylk)和TAM特異的調(diào)節(jié)子(MAFB和SPI1)沿TAM-CAFap-CAFmyo軌跡逐漸豐富，CAFap存在于這兩個調(diào)節(jié)子中（圖4 a-f）。

外周神經(jīng)樣CAF(CAF_PN) ，特異性表達(dá)周圍神經(jīng)相關(guān)基因（ MPZ, S100B, LGI4, PLP1 ）。此外， CAFPN在調(diào)節(jié)外周神經(jīng)髓鞘形成過程中增加了獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(SOX2和SOX10) ，具有明顯的代謝特征（圖4 g）。

CAF_EndMT顯示了成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞marker的雙重表達(dá)。并且，與正常組織相比，腫瘤組織種CAF_EndMT與其他細(xì)胞簇的通訊更強(qiáng)。CAF_EndMT處于從TEC到CAF_myo的過渡位置。

血管生成signature在CAF_EndMT中高度豐富。CAF_EndMT傾向于參與細(xì)胞遷移和血管發(fā)育途徑。

基于ssGSEA從TCGA隊(duì)列中估計(jì)了每個患者的CAF_EndMT打分。CAF_EndMT的高比例與幾種癌癥類型的預(yù)后不良有關(guān)（圖5）。

Results5：The triple interplay between CAFs, TECs, and TAMs in the TME

根據(jù)NicheNet分析估計(jì)，CD44在CAF_EndMT和TAM之間的相互作用計(jì)數(shù)方面排名第一，SPP1和APOE在所有受體配體對中在TAM中的表達(dá)最高。在腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)CAF_EndMT與SPP1+TAMS的相互作用多于與SPP1-TAMS的相互作用。在SPP1+TAMS與CAF_EndMT之間的相互作用中，富含SPP1_CD44。CD44的表達(dá)沿著EndMT的軌跡逐步增加，這一結(jié)果表明SPP1_CD44相互作用可能參與了EndMT過程（圖6 a-d）。

三種癌癥類型中，mIF表明一些SPP1+ TAMs (SPP1+CD68+)接近于CAF_EndMT(CD44+CD31+)。表型圖像和密度圖分別用于量化標(biāo)記的表達(dá)和空間分布。排除缺陷區(qū)域后，定量分析CAF_EndMT細(xì)胞的空間密度分布，并將其分為高密度區(qū)(HDA)和低密度區(qū)(LDA)，與LDA相比，HDA中SPP1+ TAMs明顯富集。此外，在量化空間分布時，我們發(fā)現(xiàn)在CAF_EndMT20μm內(nèi)SPP1+ TAM比值顯著高于20μm外。在7例結(jié)直腸腫瘤標(biāo)本的空間轉(zhuǎn)錄譜中，CAF_EndMT和SPP1+TAMs的signature富集之間存在顯著的相關(guān)性。

總結(jié)：

本文對多種癌癥類型的單細(xì)胞圖譜進(jìn)行了研究，對不同癌癥類型的成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜的系統(tǒng)研究揭示了癌癥和間質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性和癌癥生物學(xué)特征。大多數(shù)CAFs可能來自于局部正常成纖維細(xì)胞的激活。小部分CAFs來自內(nèi)皮細(xì)胞、周圍神經(jīng)和巨噬細(xì)胞。CAF_state3處于最去分化的狀態(tài)，與免疫細(xì)胞相互作用，預(yù)測免疫治療較差。因此，CAF分化可能促進(jìn)免疫治療患者的分層。SPP1⁺ TAMs可能通過與鄰近的CAF_EndMT相互作用參與腫瘤血管生成，導(dǎo)致癌癥不良預(yù)后。