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Hello,免疫檢查點(diǎn)抑制劑是目前治療腫瘤的最為先進(jìn)的方案之一，但是一些患者對(duì)該方案并不敏感。如何解決這個(gè)問題呢？小王本次給大家講解的就是2021年發(fā)表在雜志Oncogene(IF: 9.8)的一項(xiàng)研究，該作者是從CD8+T效應(yīng)（CD8 Teff）出發(fā)研究出一個(gè)預(yù)測(cè)模型進(jìn)而對(duì)該治療方案的效果進(jìn)行預(yù)測(cè)。接下來為大家講解作者是如何一步一步分析的。
STEP1 WGCNA的構(gòu)建和關(guān)鍵模塊的識(shí)別
（1）確定重要的模塊基因
作者從IMvigor210隊(duì)列中納入了348位轉(zhuǎn)移的尿路上皮癌患者的樣本，并選擇了方差大于不同樣本中所有四分之一方差的基因。此外，獲得了2351個(gè)基因用于進(jìn)行WGCNA，并將這些基因用聚類樹狀圖劃分為5個(gè)不同的模塊。根據(jù)CD8+T效應(yīng)與免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性，最終確定黃色的模塊基因作為構(gòu)建模型的基因集。如下圖1
（2）對(duì)模塊基因進(jìn)行富集分析
對(duì)模塊基因GO與KEGG富集分析，GO功能分析結(jié)果為T細(xì)胞活化、質(zhì)膜外、細(xì)胞因子受體結(jié)合等功能。KEGG結(jié)果為造血細(xì)胞譜系、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、結(jié)核性膀胱通路相關(guān)。
STEP2 IMS（免疫靶點(diǎn)抑制劑評(píng)分）作為一種預(yù)測(cè)因子的潛在生物學(xué)作用
(1)構(gòu)建ssGSEA評(píng)分
根據(jù)黃色模塊基因構(gòu)建了ssGSEA的評(píng)分系統(tǒng)，并量化了每個(gè)樣本的預(yù)后水平，簡(jiǎn)稱IMS。（劃重點(diǎn)）
(2)高、低IMS組的在分子分型或基因之間的分布
將高、低IMS組按照TCGA和Lund分類進(jìn)行比較，第I亞型在低MIS組中最常見，而第IV亞型最少見。Lund分類中包含一個(gè)基因組不穩(wěn)定的亞型，低IMS組的UroA亞型和高IMS組的Inf亞型所占比例最高。與高IMS組相比，低IMS組有更多FGFR3突變的患者。見圖2
作者研究顯示，低IMS組FGFR3基因標(biāo)記(FGFE3、TP63和WNT7B)的表達(dá)顯著增加，而CD8 Teff標(biāo)記、抗原加工機(jī)制;免疫檢查點(diǎn)等相關(guān)基因在高IMS組比低IMS組高表達(dá)。
(3)IMS與生存
IMS的生存分析顯示，在抗PD - L1免疫治療隊(duì)列中，低IMS組的生存獲益較差。（K-M曲線，很常規(guī)啦）
(4)IMS與治療應(yīng)答
客觀應(yīng)答組(CR/PR:完全緩解或部分緩解)的IMS顯著低于非應(yīng)答組(SD/PD:疾病穩(wěn)定或進(jìn)展)。圖4
(5)IMS與腫瘤PD-L1表達(dá)量之間的關(guān)系
隨著腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)等級(jí)的增加，IMS顯著增加。不同免疫表型間IMS也有顯著差異。
STEP3 IMS的免疫治療反應(yīng)性
可以認(rèn)為該步驟是對(duì)IMS與其它參數(shù)之間的關(guān)系，也是IMS的應(yīng)用效果的評(píng)估。
(1)利用TIDE算法并對(duì)其相關(guān)指數(shù)進(jìn)行分析
作者使用外部2031例膀胱癌樣本計(jì)算出IMS隨后再評(píng)估TIDE算法(圖5)，結(jié)果顯示IMS與TAM _M2和MDSC水平呈負(fù)相關(guān)，與CAF含量呈正相關(guān)。IMS與功能障礙呈正相關(guān)，與EXCLUDE呈負(fù)相關(guān)。IMS和TIDE評(píng)分之間有很強(qiáng)的相關(guān)性。
(2)免疫浸潤(rùn)
隨后，作者們?cè)u(píng)估了IMS與24種免疫細(xì)胞的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)IMS與M0、M1、M2巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞CD8、活化NK細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞呈正相關(guān)。 記憶B細(xì)胞、記憶活化T細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞和γ δ T細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)水平在高IMS組明顯低于低IMS組。見圖6
(3)IMS與信號(hào)通路的相關(guān)性
作者IMS與膀胱癌重要生物學(xué)通路的基因評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)IMS與免疫檢查點(diǎn)、CD8 T效應(yīng)、APM、EMT1、EMT3評(píng)分呈正相關(guān)，與FGFR3相關(guān)、TCGA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。見圖7
(4)IMS與ESTIAMTE算法
此外，經(jīng)計(jì)算，高IMS組的腫瘤純度顯著高于低IMS組。低IMS組的ESTIMATE、免疫和間質(zhì)評(píng)分顯著高于高IMS組。見圖8
STEP4 中樞基因的評(píng)估
(1)確定中樞基因
作者利用Cytoscape軟件的Cytohubba和MCODE功能，在黃色模塊中尋找10個(gè)最重要的中樞基因(B2M、CD274、HAVCR2、CD33、CD14、FOXP3、LY96、BTK、DYSF和CD300A)。隨后也分析了中樞基因可能涉及的通路，提示可能啟動(dòng)膀胱癌細(xì)胞凋亡、EMT和ER激素信號(hào)通路，并抑制PI3K/Akt通路、TSC/mTOR通路、細(xì)胞周期、DNA損傷反應(yīng)和AR激素，受體酪氨酸激酶(RTK)。圖9
(2)臨床意義分析
膀胱癌中Hub基因的表達(dá)，CR/PR組的CD274和B2M表達(dá)明顯高于SD/PD組。
(3)生存分析
B2M和CD274高表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于低表達(dá)患者，而CD300A表達(dá)較高的患者生存時(shí)間較短。
(4)B2M與膀胱癌免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性
作者特別研究了B2M基因，
首先，免疫組化分析顯示B2M在腫瘤組織中的表達(dá)高于正常組織。
接著多色免疫熒光染色探索B2M之間的相關(guān)性和腫瘤微環(huán)境。量化B2M +細(xì)胞距離腫瘤組織不同距離梯度。（圖10）
量化了不同B2M+細(xì)胞濃度梯度內(nèi)CD8+ T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞的數(shù)量（圖11），并認(rèn)為三者之間存在關(guān)聯(lián)性。
（5）拷貝數(shù)變異與免疫相關(guān)基因的表達(dá)
作者利用GSCALite web服務(wù)器挖掘公共癌癥基因表達(dá)和預(yù)后數(shù)據(jù)庫。使用該服務(wù)器分析11,160個(gè)TCGA樣本的多組學(xué)數(shù)據(jù)。對(duì)Hub基因mRNA在泛癌中的表達(dá)及其預(yù)后分析顯示，腎臟腎透明細(xì)胞癌(KIRC)中Hub基因高表達(dá)與總體獲益顯著相關(guān)，而在肺鱗癌(LUSC)中觀察到相反的趨勢(shì)。
STEP5 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建與驗(yàn)證
(1)構(gòu)建模型
以黃色模塊基因?yàn)榛A(chǔ)，將IMvigor210隊(duì)列中的患者按7:3的比例隨機(jī)分為訓(xùn)練組(244個(gè)樣本)和驗(yàn)證組(41個(gè)樣本)。采用LASSO Cox回歸分析構(gòu)建由CXCL13、ZYX、SPHK1、TLR2、MEFV、TNFSF14、UBD、LAG3 8個(gè)基因組成的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型。在模型驗(yàn)證中，訓(xùn)練組和驗(yàn)證組中的高危組的死亡率明顯高于低危組；內(nèi)部驗(yàn)證集進(jìn)一步驗(yàn)證，得到了一致的結(jié)果。ROC曲線分析評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型的敏感性和特異性，結(jié)果驗(yàn)證所建立的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)值(訓(xùn)練集:1年AUC = 0.767, 3 / 5年AUC = 0.835;驗(yàn)證集:1年AUC = 0.638, 3 / 5年AUC = 0.719）
(2)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)患者預(yù)后的影響
單變量Cox回歸分析表明，使用PD-L1免疫抑制劑治療的膀胱癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與較差的生存期相關(guān)，并且是較差OS的重要預(yù)測(cè)因子。多因素Cox回歸分析采用單因素Cox回歸分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的特征因素，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。
STEP6 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型的預(yù)后價(jià)值評(píng)估
進(jìn)一步分析模型基因發(fā)現(xiàn)CXCL13和LAG3等基因在CR/PR中的表達(dá)顯著高于SD/PD ，而ZYX和TLR2的表達(dá)則相反。
（1）評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)模型與24個(gè)免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性。
8個(gè)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型基因與大多數(shù)免疫細(xì)胞顯著相關(guān)。風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型基因與記憶B細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞等呈正相關(guān)。提示這8個(gè)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型基因可能對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)有調(diào)節(jié)作用。值得注意的是CXCL13表達(dá)于卵泡輔助T細(xì)胞本身，并且包含在用于定義卵泡輔助T細(xì)胞亞群的基因集中。
（2）逐個(gè)基因分析
使用風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型的生存分析顯示 SPHK1、TLR2和ZYX高表達(dá)患者的生存時(shí)間更短。然而，CXCL13、LAG3和UBD高表達(dá)組的生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于低表達(dá)組。
（3）重點(diǎn)基因分析
首先，免疫組化分析顯示，CXCL13在腫瘤組織中的表達(dá)高于正常組織。
接著，不同距離梯度下的腫瘤細(xì)胞數(shù)量，我們發(fā)現(xiàn)距離腫瘤細(xì)胞越遠(yuǎn)，細(xì)胞總數(shù)和CXCL13+細(xì)胞數(shù)量逐漸減少（圖12）。
腫瘤癌巢中CXCL13+細(xì)胞數(shù)量(27.15%)遠(yuǎn)低于腫瘤間質(zhì)中CXCL13+細(xì)胞數(shù)量(72.85%)。離CXCL13+細(xì)胞越遠(yuǎn)，CD8+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，這些結(jié)果表明，CXCL13+細(xì)胞可能與CD8+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞有積極的相互作用。
STEP7 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型基因的泛癌分析
（1）與免疫浸潤(rùn)之間的關(guān)系
首先，作者發(fā)現(xiàn)這八個(gè)基因的變化可能會(huì)影響免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平并且研究了30種癌癥中，發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)癌癥中ZYX的表達(dá)受到CNV的顯著調(diào)控，其次是TLR2和SPHK1。我們分析了33種癌癥中每個(gè)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型基因的雜合/純合CNVs的組成。
（2）在正常組織與癌癥組織中表達(dá)是否存在差異
又比較了模型基因在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在腎透明細(xì)胞癌中所有風(fēng)險(xiǎn)模型基因表達(dá)的差異最大。SPHK1、UBD和LAG3在LUSC中的表達(dá)水平高于正常細(xì)胞，而TLR2、MEFV、ZYX和TNFSF14的表達(dá)水平則相反。
（3）對(duì)臨床亞型的影響
模型基因?qū)εR床癌癥亞型的影響，對(duì)乳腺癌、腎透明細(xì)胞癌、肺鱗癌、肺腺癌是最顯著的。
（4）對(duì)信號(hào)通路的影響
在信號(hào)通路起始階段，模型基因主要啟動(dòng)凋亡、EMT和激素信號(hào)通路;但它們?cè)诩?xì)胞周期、DNA損傷反應(yīng)、AR和ER激素以及rtk中發(fā)揮抑制作用。
STEP8 建立預(yù)測(cè)生存的Nomogram
基于單因素和多因素Cox回歸分析結(jié)果，確定危險(xiǎn)因素構(gòu)建了包含10個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素(β(X-m)項(xiàng)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、同源重組、免疫檢查點(diǎn)水平、fancori、免疫檢查點(diǎn)效應(yīng)因子、DNA損傷修復(fù)基因、CD8+ Teff、TNB和TMB)，來預(yù)測(cè)免疫靶點(diǎn)抑制劑治療膀胱癌患者的生存率(圖13)。每個(gè)患者對(duì)每個(gè)預(yù)后參數(shù)進(jìn)行評(píng)分，總評(píng)分表明該患者預(yù)后較差。此外，校準(zhǔn)圖提示該模型具有與理想模型相似的性能。決策曲線分析(DCA)也得到了結(jié)果。
參考文獻(xiàn)：Chen, X., Xu, R., He, D. et al. CD8+ T effector and immune checkpoint signatures predict prognosis and responsiveness to immunotherapy in bladder cancer. Oncogene 40, 6223–6234 (2021). https://doi.org/10.1038/s41388-021-02019-6
