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Nature子刊：肺癌患者腸道念珠菌過度生長或與乳酸有關！
人體中的微生物有三大勢力，病毒、細菌、真菌。念珠菌在人體腸道中過度生長被認為是侵襲性念珠菌病的先決條件，腸道細菌群究竟是促進還是限制念珠菌的過度生長，仍需進一步探究。近日，Nature Communications雜志（IF：17.69）發(fā)表重磅研究《Candida expansion in the gut of lung cancer patients associates with an ecological signature that supports growth under dysbiotic conditions》，揭示肺癌患者腸道念珠菌過度生長或與乳酸有關！
本文亮點
1）納入75名無全身性念珠菌感染的晚期肺癌患者，收集其糞便，進行宏基因組和ITS測序，發(fā)現(xiàn)無感染肺癌患者念珠菌水平顯示出較高變異性；
2）根據念菌株屬的CLR豐度可將患者分為為兩組：高念珠菌組(HC，n = 38)和低念珠菌(LC，n = 37)；相比低念珠菌組，高念珠菌組菌群具有更高代謝靈活性和更低貢獻多樣性；
3）開發(fā)出機器學習模型，使用細菌分類或功能相對豐度可預測外部驗證隊列中念珠菌水平；
4）腸道念珠菌過度增長與產乳酸細菌增加、產短鏈脂肪酸和需氧細菌減少有關，念珠菌可利用乳酸作為營養(yǎng)來源促使其與腸道中其他真菌競爭。
數(shù)據來源
作者在來自匈牙利的2所肺病醫(yī)院（國立科蘭尼肺病研究所和特勒克巴林特肺病醫(yī)院）共招募了75名晚期肺癌患者，這些患者入組之前沒有任何真菌感染的證據。在單藥抗PD -1抗體免疫治療開始后(納武利尤單抗，n = 44；帕博利珠單抗，n = 31)，收集患者糞便樣本，分別進行宏基因組分析（Metagenome）和真菌組分析（Mycobiome）。
【題外話】簡單介紹幾個生物學概念：
①Microbiota（微生物群）：指研究動植物體上共生或病理的微生物生態(tài)群體。微生物群包括細菌、古菌、原生動物、真菌和病毒。
②Microbiome（微生物組）：是指除了研究微生物群體本身（細菌、古菌、原生動物、真菌和病毒）外，還研究其基因組。本文中提到的“Mycobiome”即指對微生物群中的真菌及其基因組進行分析，以下稱“真菌組”。
③Metagenome（宏基因組）：指直接研究環(huán)境樣品作為遺傳學材料，廣義來說其包括環(huán)境基因組、生態(tài)基因組學和群體基因組學。
④OUT，全稱為Operational Taxonomic Unit，在系統(tǒng)發(fā)生學研究或群體遺傳學研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元（品系，種，屬，分組等）設置的同一標志。通常按照 97% 的相似性閾值將序列劃分為不同的 OTU，每一個 OTU 通常被視為一個微生物物種。相似性小于97%就可以認為屬于不同的種（Species），相似性小于93%-95%，可以認為屬于不同的屬（Genus）。樣品中的微生物多樣性和不同微生物的豐度都是基于對OTU的分析。
溫馨提示：本文中還出現(xiàn)了很多其他的生物學概念和分析算法，小編不在這里一一贅述，如果有不明白的名詞，鼓勵各位小主自行查閱資料進行學習了解，當然，您也可以在評論區(qū)留言，如若有需要，小編會單獨再寫篇推文介紹相關概念。
結果解讀
1.無真菌感染肺癌患者中念珠菌水平的高度變異性
收集患者糞便進行真菌組分析，共獲得了76個真菌屬和113個真菌種(圖1a)，其中Candida（念珠菌屬）和Saccharomyces（酵母菌屬）是豐度最高的真菌屬(圖1b)，冗余分析(dbRDA)顯示，二者也是真菌群落多樣性變化的主要驅動因素(圖1c)。通過PCoA主坐標分析患者的年齡、性別、體重指數(shù)(BMI)、飲食習慣和抗生素使用情況對菌落多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)抗癌治療前(糞便取樣前60天)使用抗生素治療與菌群排序結果顯著相關，暗示了抗生素對腸道菌群的影響(圖1e)。
作者對不同的真菌屬進行歸一化分析，發(fā)現(xiàn)念珠菌屬的歸一化豐度之間存在高度相關性，根據念珠菌屬的CLR豐度中位數(shù)，將患者分為兩組：高念珠菌組(HC，n = 38；平均TSS = 33.4%)和低念珠菌組(LC ，n = 37；平均TSS = 0.6%)。這種高和低念珠菌分組與內轉錄間隔區(qū)（ITS）讀數(shù)顯著相關（圖1f），但與ITS總拷貝數(shù)無關（圖1g)，說明測序深度不影響分組。通過PCoA分析發(fā)現(xiàn)，HC組和LC組之間的β多樣性有顯著差異(圖1h)，但沒有觀察到α多樣性的顯著差異。
接下來，作者對用于真菌組分析的相同糞便樣本進行了宏基因組測序分析，重點關注細菌群落，特別是分類和功能特征，這可能是支持不同念珠菌種在人類腸道中生長的關鍵。評估了234個細菌種，84個細菌屬，394個MetaCyc途徑，1688種酶，5120個KEGG Orthology條目，155種KEGG途徑和1427個病毒OTU（vOTU）的相對豐度(圖1a)。為了確保在進一步的分析中只獲得細菌信息，作者使用HUMAnN2工具刪除了未知或非細菌來源的特征。分析顯示真菌和細菌物種的β多樣性之間存在顯著的相關性。細菌物種解釋了大約13%的真菌物種多樣性，使用細菌物種的dbRDA分析表明梭狀芽孢桿菌、乳桿菌、真桿菌和檸檬酸桿菌物種對真菌群落變異的解釋能力最高（圖1d）。有趣的是，細菌物種豐度與真菌物種多樣性的雙圖表明，念珠菌屬豐度與幾種乳桿菌種呈正相關（圖1e）。
2.與高念珠菌組相關的細菌和噬菌體特征
HC和LC組的細菌群落和功能β多樣性具有顯著差異，這可能是由細菌群落的功能特性(MetaCyc, KOs和ECs)引起的，因為其存在了最大的組間差異（圖2a-c），但HC組和LC組的細菌群落α多樣性(Shannon、Simpson、Pilou’s even和Chao1指數(shù))無顯著差異。令人驚訝的是，與LC組相比，MetaCyc途徑在HC組中表現(xiàn)出更高的α多樣性（圖2e），但相比之下，HC組的細菌群落對MetaCyc途徑多樣性（Simpson多樣性）的貢獻顯著降低（圖2g-f），總之，這些發(fā)現(xiàn)表明，HC組的細菌群落具有更大的代謝靈活性，但與LC組相比，覆蓋相同代謝功能的微生物群落水平降低，表明HC微生物群不那么強健。
接下來，作者根據細菌對氧氣的耐受性對其進行分層。研究發(fā)現(xiàn)，HC組中的專性厭氧菌豐度明顯低于LC組(圖2h)， 但兼性厭氧菌豐度高于LC組(圖2i)。在一個27例重癥監(jiān)護病房(ICU)患者的獨立隊列（隊列#2）中，厭氧菌和白色念珠菌（C. albicans）呈負相關，與此一致，厭氧菌的豐度與念珠菌CLR豐度呈負相關。 此外，有項研究對15名同種異體造血細胞移植患者（包括8名念珠菌感染和7名對照者）糞便和血液進行測分析發(fā)現(xiàn)，念珠菌屬的擴增與厭氧菌多樣性的顯著喪失有關。之前對小鼠進行的一項研究，發(fā)現(xiàn)念珠菌屬定植增加與抗生素治療引起的厭氧菌較少有關。因此，可以推測，HC組中需氧菌的增加及其有氧呼吸可能是所觀察到的代謝多樣性增加的原因(圖2e)。對多樣性產生逆轉錄因子(DGRs)的進一步研究顯示，HC組中DGRs噬菌體基因顯著減少(圖2j)。DGR元件利用易出錯的逆轉錄酶在其宿主的特定靶基因上誘導隨機突變進入基因組，從而產生群體范圍內的高變異性，由于DGR其目標宿主具有有益作用(例如，適應性優(yōu)勢)，因此這些噬菌體中的富集可能意味著LC組中存在更強健的細菌群體。
3.乳酸菌和產SCFA菌的豐度可準確預測念珠菌水平
作者進行了監(jiān)督機器學習(ML)，評估是否可以僅根據細菌種類或功能相對豐度將患者識別為HC組或LC組。使用SIAMCAT構建模型，對默認算法采取數(shù)據增強訓練，在11名接受免疫治療的肺癌患者隊列中驗證模型。在驗證隊列中，HC和LC使用與測試隊列相同的豐度閾值來定義。結果顯示，細菌種類豐度可以將患者分為HC或LC準確率很高(圖3a，[CV auROC] = 77.9%)和驗證隊列(圖3a，auROC = 78.6%)。對于細菌功能豐度(通過EC)，獲得了更高的準確性(圖3a;CV auROC = 80.4%；驗證隊列auROC = 82.1%)。
作者進一步研究了是否可以預測C. albicans（白色念珠菌）, C. sake（清酒念珠菌）和 C.glabrata（光滑念珠菌）的豐度水平，這3種念珠菌中是最普遍和最豐富的念珠菌物種。類似于HC組和LC組分組方法，根據每個菌種的平均CLR豐度將其分為高豐度組和低豐度組，并建立ML模型。結果顯示，鑒定出的微生物組特征可以很好地將患者分為對應的高豐度或低豐度組，測試隊列(圖3a，CV auROC：白念珠菌= 77.5%，清念珠菌:77.0%，光念珠菌：73.9%)和驗證隊列(圖3a，auROC：白色念珠菌= 86.7%，清酒念珠菌：86.7%，光念珠菌:79.2%)。
有趣的是，測試隊列中噬菌體vOTU豐度顯示出預測念珠菌豐度的潛力(圖3b，CV auROC：73%±1%)，但在驗證隊列中潛力較小(圖3b，auROC: 53-75%)。在單獨使用噬菌體組成的測試和驗證隊列中(auROC = 73%)，白色念珠菌豐度都得到了可靠的預測。提示噬菌體可能通過影響腸道微生物群間接影響念珠菌豐度，最近也有證據表明某些噬菌體直接抑制白色念珠菌。
作者進一步分析發(fā)現(xiàn)，許多細菌種類對LC的預測具有較高的穩(wěn)健性（圖3c），發(fā)現(xiàn)了很多產生短鏈脂肪酸（SCFAs）的細菌，包括Bifidobacterium adolescentis，Eubacterium rectale， Anaerotruncus colihominis， Alistipes ihumii AP11，Lachnospiraceae species，Pseudoflavonifractor capillosus和Odoribacter splanchnicus等。此外，作者監(jiān)測了這些細菌產生SCFAs的可能性，并證實LC組中富含的許多細菌種類至少可以分泌醋酸鹽、丙酸鹽或丁酸鹽中的一種。SCFAs在抑制白色念珠菌生長中的重要性已被多次報道，然而，SCFAs的抑制功能似乎在所有念珠菌中普遍存在。丙酸鹽和丁酸鹽抑制念珠菌定植的幾種機制已被提出，包括調節(jié)免疫系統(tǒng)或直接抑制。SCFAs對氧氣有效性也有重大影響，因此，在HC組中產SCFAs細菌的減少可能伴隨著兼性需氧菌的增加，于是作者測量了一部分患者尿液中的SCFAs，發(fā)現(xiàn)專性厭氧菌豐度與丁酸鹽呈顯著正相關。此外，HC組中存在耐氧菌的富集(圖3c)。有趣的是，HC組中有幾種乳酸菌明顯增加，并且在ML模型中一直被選為頂級特征(例如，Lactobacillus gasseri和Lactococcus lactis)(圖3c)。
通過分析MetaCyc途徑豐度來檢測細菌的代謝功能(圖3d)，HC中有78條通路豐富，LC中只有11條通路豐富。HC組富集的途徑之一是從己醇中產生乳酸(P461-PWY)。與厭氧菌減少的觀察結果一致，HC組好氧細菌的有氧呼吸(脂肪酸和β氧化途徑、TCA旁路、TCA循環(huán)II)和細胞膜化合物合成途徑(甲基萘酚和泛醌合成)增加。值得注意的是，通過將p值略微放寬至0.07，獲得了HC組中另外5條豐度更高的TCA循環(huán)途徑(專性自養(yǎng)生物中的TCA循環(huán)I、IV、V、VII和部分TCA循環(huán))，有效覆蓋了MetaCyc數(shù)據庫中9條TCA途徑中的6條(圖3d)，基因集富集分析證實HC組有氧呼吸水平升高。
基于產乳酸細菌的豐度增加，作者研究了與乳酸利用相關的功能，發(fā)現(xiàn)HC組的
D-乳酸脫氫酶(D-LDH)家族顯著增加(3e)。通過宏基因組代謝分析來預測整個細菌群落的代謝通量，發(fā)現(xiàn)HC組的D-乳酸分泌比LC組增加，但沒有達到統(tǒng)計學意義(P = 0.051，圖3 f)。對部分患者尿液乳酸水平進行測試發(fā)現(xiàn)，乳酸水平與白色念珠菌呈顯著正相關，與念珠菌屬豐度成正相關。此外，在隊列#2中，血清乳酸水平與白色念珠菌豐度正相關。
總之，本研究確定了一個獨特的腸道微生物特征，預測無感染肺癌患者念珠菌屬的豐度，這描述了腸道菌群失調狀態(tài)，其特征是產SCFAs細菌的系統(tǒng)性減少和耐氧微生物(包括某些乳酸菌)的增加。
4.白色念珠菌（C. albicans）在利用乳酸方面勝過釀酒葡萄球菌（S. cerevisiae）
數(shù)據表明，微生物產生乳酸、高分子氧可用性和腸道中念珠菌物種數(shù)量的增加之間可能存在聯(lián)系。為了驗證念珠菌種類可能超過其他真菌的假設，作者首先嘗試使用具有高ITS2相對豐度的樣本（>50%念珠菌reads），從7名ICU患者的糞便（隊列#2）中分離出念珠菌菌株，共獲得了7個活菌分離株，其中有4株白色念珠菌被用于進一步的實驗。在本研究研究隊列中，酵母菌是白色念珠菌的主要競爭對手，作者選擇了一株能夠在體內定植人類的人相關釀酒酵母菌株（YJM128）進行后續(xù)的實驗。
首先，作者對所有菌株在不同碳源（葡萄糖或乳酸+葡萄糖[Glu + Lac]）和不同氧水平（微氧或有氧）上進行了個體體外生長實驗(圖4a）。在有氧（正常氧）條件下，與單一葡萄糖相比，菌株在Glu + Lac培養(yǎng)基中的指數(shù)階段生長速率均顯著降低。在微好氧條件下，兩株白色念珠菌菌株在碳源之間沒有顯著差異。為了評估念珠菌和酵母菌種類之間的直接競爭，將每個白色念珠菌分離物與釀酒酵母共培養(yǎng)（圖4b）。與釀酒酵母菌株YJM128相比，有氧條件下，在Glu + Lac培養(yǎng)基中白色念珠菌占據明顯優(yōu)勢；微需氧條件下，4株白色念珠菌菌株中的3種占據明顯優(yōu)勢。此外，白色念珠菌在Glu + Lac培養(yǎng)基中的生長優(yōu)勢略高于單一葡萄糖培養(yǎng)（圖4b）。
總的來說，作者發(fā)現(xiàn)白色念珠菌在體外常氧條件下利用乳酸方面比釀酒酵母具有生長優(yōu)勢。盡管在下消化道可能會出現(xiàn)較高氧水平的微生態(tài)位，但微有氧條件下的結果更能代表這兩種酵母在人類腸道中的真正競爭環(huán)境。在這種情況下，3株白色念珠菌在使用Glu + Lac培養(yǎng)基時，與僅使用葡萄糖相比，比釀酒酵母YLM128具有更強的生長優(yōu)勢。
總結
作者通過宏基因組學數(shù)據和體外競爭實驗揭示了與念珠菌水平相關的強大細菌組特征。即在低氧條件下，由于SCFAs產生菌的減少，念珠菌可將腸道中額外的乳酸作為碳源而獲得競爭優(yōu)勢，這一發(fā)現(xiàn)非常值得進一步關注。但是，我們不得不承認，人體腸道是個高度復雜的環(huán)境，包含成千上萬種微生物菌群，免疫系統(tǒng)、微生物、腫瘤三者是又是相互塑造的，體外實驗很難模擬腫瘤患者真實腸道情況，想徹底弄清肺癌患者腸道念珠菌過度生長與乳酸的關系，任重而道遠！
參考文獻：
Seelbinder B，et al. Candida expansion in the gut of lung cancer patients associates with an ecological signature that supports growth under dysbiotic conditions. Nat Commun. 2023 May 9;14(1):2673. doi: 10.1038/s41467-023-38058-8. PMID: 37160893; PMCID: PMC10169812.
