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研究腫瘤微環(huán)境及腫瘤異質(zhì)性，通常的方式是基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。Nature communication近日的研究，介紹了基于拷貝數(shù)變異和斷點(diǎn)的檢測算法SCEVAN，該算法能夠自動(dòng)、準(zhǔn)確地區(qū)分惡性和非惡性細(xì)胞。將該算法應(yīng)用于來自不同腫瘤類型和測序技術(shù)的106個(gè)樣本，共計(jì)93,322個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)集，可證明該方法可表征腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性和惡性腦腫瘤的空間演變。
論文標(biāo)題：A variational algorithm to detect the clonal copy number substructure of tumors from scRNA-seq data
論文地址：https://www.nature.com/articles/s41467-023-36790-9
1 SCEVAN 如何基于拷貝數(shù)及斷點(diǎn)進(jìn)行亞克隆判別
了解腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和腫瘤細(xì)胞與免疫系統(tǒng)之間的相互作用是解釋腫瘤治療失敗，理解腫瘤生長和進(jìn)化的關(guān)鍵步驟。通常的研究套路，是將來自腫瘤活檢的大量未分選的細(xì)胞進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析，根據(jù)特定標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)一步分亞群，然后將細(xì)胞分類為惡性腫瘤細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞。常用的標(biāo)記是轉(zhuǎn)化后細(xì)胞所具有的獨(dú)特性拷貝數(shù)變化。然而，之前的方法需要人工識(shí)別，適用于高覆蓋率和低維度的Smart-seq 數(shù)據(jù)，而新方法SCEVAN能克服這些問題，在合成和真實(shí)數(shù)據(jù)上表現(xiàn)出更快和更準(zhǔn)確地識(shí)別出腫瘤的亞克隆。
SCEVAN的分類邏輯，是假設(shè)給定拷貝數(shù)的克隆中，對(duì)應(yīng)的所有細(xì)胞共享相同的斷點(diǎn)。因此，每個(gè)細(xì)胞的平滑表達(dá)譜構(gòu)成了判別每個(gè)亞克隆中拷貝數(shù)譜的證據(jù)。其具體流程如下圖所示，從原始的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜開始，去除低表達(dá)的基因和細(xì)胞（圖1a）。之后依次從留下的高表達(dá)細(xì)胞基線去除獲得的不同細(xì)胞的相對(duì)基因表達(dá)量（圖1b），對(duì)相對(duì)基因表達(dá)的邊緣進(jìn)行非線性擴(kuò)散濾波（圖1c），根據(jù)變分區(qū)域進(jìn)行分割（圖1d）。鑒定正常細(xì)胞，即包含大多數(shù)正常細(xì)胞的簇（圖1e）。對(duì)于腫瘤細(xì)胞，使用 Louvain 聚類的共享最近鄰圖鑒定可能的亞克?。▓D1f）。 應(yīng)用變分區(qū)域生長算法對(duì)每個(gè)亞克隆進(jìn)行分割（圖1g）。然后根據(jù)拷貝數(shù)狀態(tài)將腫瘤細(xì)胞分為五個(gè)亞克?。▓D1g）。 圖1H展示了亞克隆共享及特異的通路活性。
圖1 SCEVAN的任務(wù)流程及輸入輸出
2 SCEVAN在真實(shí)樣本惡性腫瘤細(xì)胞分類中的性能
對(duì)于三種不同癌癥類型的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM) ，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC) ，大腸癌)和來自不同測序技術(shù)(Smart-seq2,10X Chromium)，共包含106個(gè)樣本和93,322個(gè)細(xì)胞，使用 SCEVAN和之前基于CNV的分類工具的CopyKAT對(duì)比分類準(zhǔn)確性，可以看到在三種癌種，大多數(shù)樣本中，SCEVAN的準(zhǔn)確性（F1值）都高于CopyKAT。具體來看，SCEVAN 在63% 的樣本中取得較佳的分類評(píng)分，而 CopykAT 在23% 的樣本中取得較佳的分類評(píng)分。所有樣本上，SCEVAN的 F1只為0.90，而用 CopyKAT 的 F1值為0.63。
圖2 在真實(shí)癌癥數(shù)據(jù)，使用SCEVAN分類惡性細(xì)胞的F1值對(duì)比
3 使用SCEVAN可得到更準(zhǔn)確的拷貝數(shù)變異
將同樣本的bulk RNA數(shù)據(jù)及WGS數(shù)據(jù)檢測出的拷貝數(shù)作為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)SCEVAN及其它同類軟件，如 inferCNV, CopyKAT 基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)檢測拷貝數(shù)變異的準(zhǔn)確度。圖3a和b分別是不同軟件各染色體中檢出的拷貝數(shù)變異，圖3c和d是對(duì)應(yīng)的皮爾森相關(guān)系數(shù)。可以從圖3a和b中最上的圖（金標(biāo)準(zhǔn)）與之下不同方法的圖檢出的拷貝數(shù)變異結(jié)果對(duì)比，可以看到SCEVAN檢出的變異更多且更準(zhǔn)，而圖3c和d對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù),SCEVAN最高，也反映了這一情況。同樣的結(jié)果，在模擬數(shù)據(jù)中也會(huì)出現(xiàn)，這些結(jié)果說明SCEVAN能夠從單細(xì)胞數(shù)據(jù)中得到準(zhǔn)確度拷貝數(shù)變異譜。
圖3，對(duì)比不同軟件對(duì)單細(xì)胞拷貝數(shù)變異檢測的準(zhǔn)確度
而執(zhí)行時(shí)間上，SCEVAN 的執(zhí)行時(shí)間，在惡性和非惡性細(xì)胞的區(qū)分任務(wù)上，相比InferCNV快2-7倍，在腫瘤區(qū)域分割任務(wù)上，相比CopyKAT 快2倍，比Infer CNV 快5倍。對(duì)于來自10X的單細(xì)胞數(shù)據(jù)，由于其包含的細(xì)胞數(shù)偏多，CopyKAT顯得尤其慢，此時(shí)SCEVAN 比Infer CNV 快11倍，比 CopyKAT 快19倍。這說明了SCEVAN 在計(jì)算上更有效率。
4 使用SCEVAN研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的腫瘤微環(huán)境
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是最具侵襲性的腦腫瘤，具有高度異質(zhì)性，包括幾種克隆和亞克隆腫瘤細(xì)胞群，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，以及免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。SCEVAN 可以通過分析顯示出具有顯著不同基因組改變的 CNA 基質(zhì)簇，從單細(xì)胞數(shù)據(jù)中自動(dòng)推斷克隆亞結(jié)構(gòu)。
為了論證SCEVAN的準(zhǔn)確性，選擇MGH105樣本，該樣本已經(jīng)過甲基化數(shù)據(jù)，驗(yàn)證其存在4個(gè)亞克隆。經(jīng)過單細(xì)胞數(shù)據(jù)，SCEVAN 揭示了三個(gè)腫瘤細(xì)胞亞群的存在，如圖4a，聚類結(jié)果見圖4b?？寺涞南到y(tǒng)發(fā)育重建顯示兩個(gè)緊密克隆(亞克隆1和2)和顯著遠(yuǎn)的第三個(gè)亞克隆(圖4c)，與聚類結(jié)果相符。圖4d展示了不同亞克隆之間共有（例如Chr 10上的缺失(q22.1-q26.3)）及特異的拷貝數(shù)變異。通過通路特異性分析，發(fā)現(xiàn)亞克隆1(淺藍(lán)色)富集神經(jīng)元亞型特征的途徑，亞克隆2(藍(lán)色)具有屬于線粒體的細(xì)胞，亞克隆3(綠色)含有具有增殖/祖細(xì)胞亞型的細(xì)胞（圖4e）。為了確定不同細(xì)胞狀態(tài)的驅(qū)動(dòng)因素，我們對(duì)亞克隆特異性改變區(qū)域中具有基因組坐標(biāo)的基因進(jìn)行了差異分析。位于亞克隆3特異性改變中的最高差異表達(dá)基因是泛素綴合酶 E2T (UBE2T)基因，其表達(dá)顯著上調(diào)，該基因位于DNA 修復(fù)通路上，這可以部分解釋該亞克隆的致癌成因。
圖4，使用SCEVAN發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的異質(zhì)性
此外，拷貝數(shù)亞結(jié)構(gòu)的分析可以表征特定腫瘤相關(guān)基因的克隆狀態(tài)。在樣品 BT1160和 MGH102中，SCEVAN 顯示腫瘤抑制基因 CDKN2A 和 PTEN 的改變只發(fā)生在部分亞克隆中（圖5）。在樣本BT1160中，含有 PTEN (10q23.31)的 Chr 10(q22.1-q26.3)上的缺失在三個(gè)亞克隆中的兩個(gè)之間共享，而在其余的亞克隆中，該缺失不存在。這些結(jié)果表明，SCEVAN 可以從 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中解析腫瘤中的克隆拷貝數(shù)亞結(jié)構(gòu)，并識(shí)別亞克隆差異和膠質(zhì)瘤特異性癌癥狀態(tài)。
圖5，SCEVAN基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組對(duì)兩個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤區(qū)分亞克隆之后的拷貝數(shù)變異
4 使用SCEVAN研究腫瘤的進(jìn)化與轉(zhuǎn)移
圖6展示了在多次活檢數(shù)據(jù)中，使用 SCEVAN進(jìn)行推測的結(jié)果。有七個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤活組織檢查，兩個(gè)在腫瘤周邊，其余在腫瘤的核心。用 SCEVAN 對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行克隆分析，可以推斷出克隆的進(jìn)化樹(圖6)。拷貝數(shù)改變沿著幾個(gè)分支發(fā)展，腫瘤周圍樣品(P2/P3)位于與核心樣品分離的分支中，其中4號(hào)和8號(hào)染色體沒有擴(kuò)增。此外，存在于 Chr 2上的擴(kuò)增在外周樣品中是完全出現(xiàn)，而在中間的部分只是部分出現(xiàn)，這說明了該突變的演化順序。
圖6，對(duì)多次活檢樣本使用SCEVAN進(jìn)行時(shí)序分析得到的進(jìn)化樹
SCEVAN還可以鑒別原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移之間的相似性，針對(duì)原發(fā)性 HNSCC 腫瘤和相應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。SCEVAN發(fā)現(xiàn)患者(HNSCC5)在原發(fā)腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間呈現(xiàn)不同的克隆結(jié)構(gòu)，特別是在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中沒有擴(kuò)增7號(hào)染色體(p22.3-p13) ，如圖7所示。只在一個(gè)樣本中，轉(zhuǎn)移和原發(fā)腫瘤細(xì)胞的拷貝數(shù)之間存在差異，不同的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞中下調(diào)的GPNMB基因， 在多種情況下被證明增加腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。而對(duì)于其余患者(HNSCC20，HNSCC25，HNSCC26，HNSCC28) ，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的克隆結(jié)構(gòu)似乎與原發(fā)腫瘤相同。轉(zhuǎn)移和原發(fā)腫瘤細(xì)胞的拷貝數(shù)之間高度相關(guān)性(皮爾遜相關(guān)系數(shù)在0.79和0.89之間)表明 SCEVAN 可用于研究轉(zhuǎn)移癌的克隆進(jìn)化。
圖7：使用SCEVAN在4個(gè)原發(fā)腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鑒定拷貝數(shù)變異并發(fā)現(xiàn)存在高度相關(guān)性
5 總結(jié)
使用大量不同腫瘤類型，不同的單細(xì)胞技術(shù)的注釋數(shù)據(jù)集，該研究證實(shí) SCEVAN 比最先進(jìn)的方法能更準(zhǔn)確、更快的基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)檢測拷貝數(shù)變異（CNA），并根據(jù)CNA差異描繪實(shí)體腫瘤中的克隆亞結(jié)構(gòu)，以及研究腫瘤的時(shí)間和亞克隆之間的演化。亞克隆的功能分析揭示了細(xì)胞狀態(tài)的驅(qū)動(dòng)因素，以及原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間差異的驅(qū)動(dòng)基因。使用SCEVAN可擴(kuò)展單細(xì)胞數(shù)據(jù)的分析范圍，通過找到的拷貝數(shù)差異，可結(jié)合甲基化等數(shù)據(jù)，進(jìn)行多組學(xué)分析，從而進(jìn)一步研究腫瘤的微環(huán)境及異質(zhì)性。
