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大家好呀，今天分享的文章題為通過對多種癌癥的單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析揭示了腫瘤和正常組織之間的內(nèi)皮細(xì)胞的差異，于今年一月發(fā)表在《Computational and Structural Biotechnology Journal》（IF = 6.155）上，文章整合了6種癌癥的單細(xì)胞數(shù)據(jù)，讓我們一起學(xué)習(xí)一下吧！
一、摘要
內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）在腫瘤進(jìn)展中起著重要作用。目前，抗血管生成治療的主要靶點(diǎn)是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）通路?？筕EGF/VEGFR治療由于其對正常EC的作用，可能導(dǎo)致腎毒性和心血管相關(guān)的副作用。因此，有必要識別腫瘤EC特異性靶點(diǎn)，可應(yīng)用于各種癌癥類型。本文整合了來自6種癌癥類型的scRNA-seq數(shù)據(jù)，構(gòu)建了一個(gè)多癌癥EC圖譜來解析腫瘤EC的特征。發(fā)現(xiàn)尖狀EC主要存在于腫瘤組織中，而很少存在于正常組織中。尖狀EC參與促進(jìn)腫瘤血管生成和抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，腫瘤細(xì)胞、髓系細(xì)胞和周細(xì)胞是促血管生成因子的主要來源。在多種癌癥類型中，尖狀EC的高比例與不良預(yù)后相關(guān)。還發(fā)現(xiàn)了PSMA是非前列腺癌中尖端樣ECs的特異性標(biāo)記物（流程圖：圖1）。
二、結(jié)果
1、多種癌細(xì)胞圖譜的構(gòu)建
本文收集了6種癌癥類型的scRNA-seq數(shù)據(jù)，包括結(jié)直腸癌（CRC）、胃癌（GC）、肺癌LC、卵巢癌（OVC）、胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）和腎細(xì)胞癌（RCC），對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行單細(xì)胞分析構(gòu)建多癌細(xì)胞圖譜，其中包括來自83個(gè)腫瘤樣本和30個(gè)正常組織的220075個(gè)細(xì)胞，對其進(jìn)行去批次和質(zhì)量控制。根據(jù)標(biāo)記基因?qū)⒓?xì)胞分為13個(gè)不同的細(xì)胞簇：B細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞和周細(xì)胞（圖2）。
2、對scRNA-seq和bulk RNA-seq數(shù)據(jù)的綜合分析揭示了腫瘤組織和正常組織之間EC組成的差異
作者從整合好的多癌癥細(xì)胞圖譜中提取EC，一共10277個(gè)ECs，并將其重新劃分為6個(gè)細(xì)胞亞群：動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、毛細(xì)血管ECs 1、毛細(xì)血管ECs 2、尖狀EC、淋巴EC。毛細(xì)血管ECs 1存在于各種組織中，而毛細(xì)血管ECs 2主要存在于腎臟中，可能是一種組織特異性的EC亞簇(圖3d)。在研究的所有癌癥類型中，尖狀EC主要存在于腫瘤組織中，而在正常組織中幾乎不存在。其他EC亞群在腫瘤組織和正常組織中不存在差異。
作者利用構(gòu)建的多種癌癥單細(xì)胞圖譜作為背景基因集，使用CIBERSORTx算法對TCGA進(jìn)行反褶積計(jì)算。為了檢驗(yàn)反褶積計(jì)算的尖狀EC比例的準(zhǔn)確性，分析了尖狀EC基因特征的富集評分與多種癌癥類型中尖狀EC比例之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)基因特征與尖狀EC比例呈正相關(guān)，表明尖狀EC比例的預(yù)測是基于尖狀EC中特異性基因表達(dá)。結(jié)果還顯示，在大多數(shù)癌癥類型中，腫瘤組織中尖狀EC的比例明顯高于正常組織，這與多癌scRNA-seq數(shù)據(jù)的結(jié)果一致。同樣，包括動(dòng)脈EC、靜脈EC和淋巴EC等三個(gè)EC簇的比例，在多種癌癥類型的腫瘤組織和正常組織中也沒有差異。有趣的是，COAD、KICH、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、THCA等7種腫瘤中總ECs的比例均高于正常組織，這表明這些腫瘤組織中的血管生成更為活躍（圖3）。
3、尖狀EC代表一種活化的EC亞簇，可以促進(jìn)腫瘤血管生成同時(shí)抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)
作者研究了尖狀ECs的分子特征，GSVA分析顯示尖狀ECs在Notch信號、Wnt/β-連環(huán)蛋白信號、血管生成和蛋白分泌通路富集。表明尖狀ECs代表了一個(gè)活化的EC亞簇，促進(jìn)腫瘤血管生成。毛細(xì)血管ECs 2在炎癥相關(guān)通路中富集，如炎癥反應(yīng)和TNF-α信號通路。相比之下，毛細(xì)血管ECS 1可能處于靜息狀態(tài)。使用GSVA對尖狀ECs進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)參與鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附負(fù)調(diào)控的基因集富集，表明尖狀ECs可能通過誘導(dǎo)血管通透性促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。
本文通過細(xì)胞通訊分析研究尖狀ECs如何影響TME，在本研究的六種癌癥類型中，MIF-CD74在尖狀ECs和免疫細(xì)胞之間高度富集。最近的研究表明，MIF-CD74可以通過招募腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）或直接抑制T細(xì)胞活化來抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，尖狀ECs可能通過與多種免疫細(xì)胞的作用來抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。在多種癌癥類型中，尖狀ECs與CD8+ T細(xì)胞之間呈顯著負(fù)相關(guān)，表明尖端樣ECs可能抑制CD8+ T細(xì)胞的浸潤?？傊鉅頔Cs代表了一個(gè)活化的EC亞簇，它可能促進(jìn)腫瘤血管生成，同時(shí)抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)（圖4）。
4、腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和髓系細(xì)胞是促血管生成因子的主要來源
TME具有高水平的促血管生成因子，如VEGF、胎盤生長因子（PlGF，由PGF編碼）、血小板源性生長因子（PDGF）和成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）。因此，作者進(jìn)行了細(xì)胞通信分析來確定這些促血管生成因子的來源。結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、髓系細(xì)胞和周細(xì)胞均可分泌VEGFA或PlGF。進(jìn)一步分析顯示，腫瘤細(xì)胞和髓系細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，是VEGFA的主要來源，而周細(xì)胞是PlGF的主要來源（圖5）。
6、在多種癌癥類型中尖狀ECs的高比例與臨床結(jié)果較差相關(guān)
為了進(jìn)一步評估尖狀ECs比例與患者總生存期的相關(guān)性，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中不同癌癥類型的患者按尖狀ECs比例（高或低）分為兩組進(jìn)行生存分析。結(jié)果顯示，較高的尖狀ECs比例相關(guān)在LUAD、OV、STAD、CESC、KIRP、BLCA和UCEC等多個(gè)癌癥隊(duì)列中，臨床結(jié)果較差。(圖6)
6、 PSMA是非前列腺癌中尖狀ECs的特異性標(biāo)記物
以上結(jié)果表明，尖狀ECs在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，可作為癌癥治療的潛在靶點(diǎn)。為了確保精確的靶向，作者系統(tǒng)地評估了尖狀ECs中的特異性膜標(biāo)記物。CXCR4是尖狀ECs的常用標(biāo)記物，其在尖狀ECs中的表達(dá)量高于其它EC亞群。然而，CXCR4在大多數(shù)免疫細(xì)胞中也有表達(dá)，因此它不是尖狀ECs的理想標(biāo)記物。為了識別出針對尖狀ECs的更特異性的膜標(biāo)記物，本文篩選了所有的膜分子。首先，篩選了在尖狀ECs中高表達(dá)的基因，然后通過查詢數(shù)據(jù)庫來選擇膜分子。結(jié)果表明，其含量特別高在尖狀ECs中表達(dá)的膜分子包括CA2、INSR、HTRA1、MCAM、CDH13、PLVAP、THY1、TNFRSF4、LAMA4、PXDN、FOLH1和EDNRB。比較它們在不同EC亞簇中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FOLH1是唯一在尖狀ECs和其它EC亞簇中差異表達(dá)的。此外，只有不到5%的上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞有FOLH1的表達(dá)。因此，本文提出前列腺特異性膜抗原（PSMA，F(xiàn)OLH1編碼）可以作為尖狀ECs的特異性標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)（圖7）。
三、小結(jié)
作者是如何整合6套癌癥單細(xì)胞數(shù)據(jù)的呢？
1、我們通過HGNChelper包更新了所有scRNA-Seq基因表達(dá)矩陣的基因符號。
2、使用Seurat中單個(gè)癌癥類型的基因表達(dá)矩陣生成了六個(gè)Seurat對象（過濾：排除少于200個(gè)基因的細(xì)胞，超過8000個(gè)基因的細(xì)胞，超過25%的線粒體基因和超過1%的hemoglobin基因的細(xì)胞）
3、將所有的Seurat對象合并，構(gòu)造一個(gè)組合的Seurat對象。合并后的Seurat對象進(jìn)行NormalizeData、ScaleData、Find Variable Features（選了2000個(gè)）和RUNPCA處理，接下來使用Harmony軟件包的RunHarmony函數(shù)對不同樣本的Seurat OB進(jìn)行集成，并校正批處理效應(yīng)。
4、使用Find Neighbors 和 Find Clusters函數(shù)在分辨率為3的情況下進(jìn)行聚類，使用50個(gè)主成分進(jìn)行分析并應(yīng)用UMAP對細(xì)胞圖譜進(jìn)行可視化。
本文整合了多種癌癥的數(shù)據(jù)，提取其中的EC細(xì)胞亞群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)尖狀EC主要存在于腫瘤組織中，而很少存在于正常組織中。尖狀EC參與促進(jìn)腫瘤血管生成和抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，腫瘤細(xì)胞、髓系細(xì)胞和周細(xì)胞是促血管生成因子的主要來源。在多種癌癥類型中，尖狀EC的高比例與不良預(yù)后相關(guān)。還發(fā)現(xiàn)了PSMA是非前列腺癌中尖端樣ECs的特異性標(biāo)記物。本文的亮點(diǎn)在于：1、通過6種癌癥數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選分析，得出的結(jié)論更具有說服力；2、將單細(xì)胞數(shù)據(jù)當(dāng)背景基因集對TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋，無論是在scRNA-seq數(shù)據(jù)的角度還是在bulk RNA-seq數(shù)據(jù)的角度都比較了尖狀EC在腫瘤組織和正常組織中含量的差異；3、通過細(xì)胞通訊的分析確定了促血管生成因子的主要來源；4、通過尖狀ECs中的特異性膜標(biāo)記物的篩選得到了作為尖狀ECs的特異性標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。本篇文章對多套數(shù)據(jù)的整合處理方法也是非常完善的，我們可以學(xué)習(xí)其對多種癌癥單細(xì)胞數(shù)據(jù)的整合方法以及作者對于每一個(gè)得到的結(jié)論通過數(shù)據(jù)驗(yàn)證的同時(shí)積極驗(yàn)證這個(gè)結(jié)論在其他癌癥中是否會(huì)存在相同結(jié)論的思考問題方式。
參考文獻(xiàn)：Zhang J, Lu T, Lu S, Ma S, Han D, Zhang K, Xu C, Liu S, Gan L, Wu X, Yang F, Wen W, Qin W. Single-cell analysis of multiple cancer types reveals differences in endothelial cells between tumors and normal tissues. Comput Struct Biotechnol J. 2022 Dec 30;21:665-676. doi: 10.1016/j.csbj.2022.12.049 . PMID: 36659929 ; PMCID: PMC9826920 .
