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大家好，虎年春節(jié)快樂。各位小伙伴們近期是不是在工作之余關(guān)注冬奧會(huì)和搶購冰墩墩呢？但作為一名科研狗，有時(shí)間的話還是不要忘記跟蹤前言領(lǐng)域的學(xué)術(shù)進(jìn)展情況吆！來吧，今天給大家分享的是2022年1月份發(fā)表在Nature communication（IF=14.9）上的一篇文獻(xiàn)，文章是利用單細(xì)胞測(cè)序探究前列腺癌上皮細(xì)胞的狀態(tài)，為剖析疾病發(fā)展及后續(xù)治療提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
Single-cell analysis of human primary prostate cancer reveals the heterogeneity of tumor-associated epithelial cell states
人類原發(fā)性前列腺癌的單細(xì)胞分析揭示了腫瘤相關(guān)上皮細(xì)胞狀態(tài)的異質(zhì)性
摘要：前列腺癌是全球男性中常見的第二大惡性腫瘤。為了描述前列腺癌腫瘤微環(huán)境特征，作者對(duì)前列腺活檢樣本、前列腺切除標(biāo)本和局限性前列腺癌患者來源的類器官進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序。作者發(fā)現(xiàn)以高雄激素信號(hào)狀態(tài)為標(biāo)志的前列腺上皮細(xì)胞存在異質(zhì)性，且在前列腺癌中富集，并確定了一群可能與前列腺癌發(fā)生相關(guān)的腫瘤相關(guān)細(xì)胞。與ERG+細(xì)胞相比，ERG-腫瘤細(xì)胞與周圍管腔上皮細(xì)胞表現(xiàn)出共同異質(zhì)性，并可能引起常見的腫瘤微環(huán)境反應(yīng)。最終，作者發(fā)現(xiàn)前列腺上皮類器官擁有與腫瘤相關(guān)上皮細(xì)胞狀態(tài)，并富含與其親本組織不同的細(xì)胞類型和狀態(tài)。本文結(jié)果提供了診斷相關(guān)的見解，并推進(jìn)了與前列腺癌發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞狀態(tài)的理解。
方法：
1.樣本來源：作者獲得6例前列腺癌患者活檢樣本，4例根治性前列腺切除術(shù)患者腫瘤樣本，4例配對(duì)樣本（含腫瘤組織和正常組織）；即：6例活檢樣本、8例根治性前列腺切除術(shù)腫瘤樣本、4例正常樣本。
2.單細(xì)胞RNA-seq：Seq-Well測(cè)序平臺(tái)。
3.WES：3例患者的腫瘤組織和配對(duì)的正常組織進(jìn)行WES測(cè)序。
結(jié)果：
1.前列腺癌（PCa）樣本單細(xì)胞RNA測(cè)序概述和局限性前列腺癌主要細(xì)胞類型的鑒定
通過對(duì)樣本分析獲得21743個(gè)細(xì)胞，共鑒定出9種不同的主要細(xì)胞類型，通過特定的基因表達(dá)譜進(jìn)行標(biāo)記（圖1a，b），并對(duì)每個(gè)細(xì)胞群中差異表達(dá)前10的基因進(jìn)行了熱圖分析（圖1c）。對(duì)11個(gè)患者細(xì)胞組成分析發(fā)現(xiàn)，每個(gè)樣本中均包含了所有主要細(xì)胞類型，上皮細(xì)胞占比最高（圖1d）。三類樣本類型之間無顯著差異（圖1e）。
圖1 前列腺癌樣本單細(xì)胞RNA測(cè)序概述和局限性前列腺癌主要細(xì)胞類型的鑒定
2.上皮細(xì)胞簇揭示了腫瘤細(xì)胞和周圍非腫瘤上皮細(xì)胞的異質(zhì)性
為了確定與前列腺癌相關(guān)的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，作者通過聚類分析確定了20個(gè)細(xì)胞簇（圖2a）。表達(dá)KRT5、KRT15、KRT17和TP63的細(xì)胞簇（圖2b）和顯著上調(diào)基底上皮細(xì)胞（basal epithelial cells）特征評(píng)分的被鑒定為基底上皮（basal epithelial，BE）。鑒于腫瘤細(xì)胞主要表達(dá)KLK2、KLK3、ACPP和NKX3-1等LE細(xì)胞標(biāo)記物，具有高LE評(píng)分的細(xì)胞既可以是腫瘤細(xì)胞，也可以是非惡性LE細(xì)胞（圖2b）。BE和LE特征圖還顯示出另外一群細(xì)胞群（簇5），稱之為其他上皮細(xì)胞（other epithelial cells，OE）（圖2a，c），具有較低BE和LE評(píng)分。作者發(fā)現(xiàn)在四個(gè)細(xì)胞簇中，ERG+腫瘤細(xì)胞ERG表達(dá)上調(diào)（圖2b）。這11個(gè)簇包括之前注釋的4個(gè)ERG+腫瘤細(xì)胞簇和7個(gè)ERG不表達(dá)的簇（將其注釋為ERG-negative（ERG-）腫瘤細(xì)胞）（圖2c）。與非腫瘤LE細(xì)胞相比，ERG-腫瘤細(xì)胞的特征是富集了至少一個(gè)已知的前列腺癌基因集，且高表達(dá)腫瘤標(biāo)志物（如SPON2和PCA3）(圖2b)。
為了檢驗(yàn)注釋方法是否準(zhǔn)確識(shí)別每種上皮細(xì)胞類型，作者計(jì)算了每種細(xì)胞類型前10的生物標(biāo)志物（圖2d）。BE細(xì)胞高表達(dá)基底上皮細(xì)胞標(biāo)志物KRT5、KRT15、KRT17。OE群中排前10的標(biāo)志物有PSCA、PIGR、MMP7、SCGB1A1和LTF，其中PSCA在前列腺癌中上調(diào)，SCGB1A1是肺細(xì)胞標(biāo)志物。ERG+和ERG-腫瘤細(xì)胞和非惡性LE細(xì)胞均高表達(dá)腔內(nèi)標(biāo)志物KLK3、KLK2和ACPP。ERG+腫瘤細(xì)胞以表達(dá)ERG和PCA3、AMACR、TRPM8為特征，ERG-腫瘤細(xì)胞以表達(dá)PCA3和TRPM8為特征（圖2d）。
先前一項(xiàng)正常人前列腺單細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)了兩組其他的上皮細(xì)胞：以KRT13、SERPINB1、CLDN4和APOBEC2表達(dá)為特征的“丘細(xì)胞”（hillock cells）和以SCGB3A1、PIGR、MMP7、CP和LCN2表達(dá)為特征的“棒狀細(xì)胞”（club cells）。在本研究中雖未發(fā)現(xiàn)第一群細(xì)胞（hillock cells），但確實(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)獨(dú)特的群體，它與第二群細(xì)胞類似，占所有上皮細(xì)胞的6.5%，它表達(dá)PIGR、MMP7、CP和LTF（圖2d）。作者就假設(shè)這個(gè)上皮細(xì)胞簇代表了以前在肺和正常前列腺標(biāo)本中描述過的club細(xì)胞。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者將一個(gè)正常的前列腺club細(xì)胞基因集投射到上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)club細(xì)胞評(píng)分高的細(xì)胞很大程度上與OE簇重疊（簇5）（圖2e）。此外，與其他細(xì)胞簇相比，該簇含豐富的club特征（圖2f）。
圖2 腫瘤細(xì)胞和主要上皮細(xì)胞類型鑒定
3.Club細(xì)胞和BE細(xì)胞有前列腺癌富集的LE樣細(xì)胞狀態(tài)且AR信號(hào)中上調(diào)
Club細(xì)胞在前列腺癌分析中尚未被確定。由于作者在前列腺癌樣本中只捕獲了club細(xì)胞，而沒有捕獲“丘細(xì)胞”細(xì)胞，假設(shè)club細(xì)胞可能與癌變有關(guān)，在某些細(xì)胞狀態(tài)下，前列腺癌club細(xì)胞可能被富集。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者將前列腺癌club細(xì)胞與之前健康對(duì)照研究中正常club細(xì)胞結(jié)合，檢測(cè)到6種具有不同轉(zhuǎn)錄組譜的細(xì)胞狀態(tài)（圖3a）。與正常樣本club細(xì)胞相比，前列腺癌club細(xì)胞表現(xiàn)出LCN2和SCGB3A1基因下調(diào)，以及LTF、AR和AR下游成員包括KLK3、KLK2、ACPP和NKX3-1上調(diào)（圖3b）。
對(duì)于這六個(gè)亞群來說，均存在不同的差異表達(dá)基因（圖3c），細(xì)胞簇0中前列腺癌club細(xì)胞中占45%以上，且前列腺癌Club細(xì)胞占比是正常club細(xì)胞的3倍以上（圖3d）。該簇特點(diǎn)是LTF、腔內(nèi)標(biāo)記物和AR通路下游基因KLK2、KLK3、ACPP、PLA2G2A和NKX3-1表達(dá)較高（圖3e），表明其處于腔樣和雄激素應(yīng)答狀態(tài)。
細(xì)胞簇0中明顯上調(diào)的基因集是雄激素反應(yīng)通路（圖3f）。接下來，作者測(cè)試這種前列腺癌富含的細(xì)胞狀態(tài)是否代表腔樣細(xì)胞狀態(tài)。作者發(fā)現(xiàn)與其他細(xì)胞狀態(tài)相比，細(xì)胞簇0的LE評(píng)分很高（圖3g）。作者比較了細(xì)胞簇0、其他聚類細(xì)胞和前列腺癌樣本中的LE和club細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)club細(xì)胞簇0比其他細(xì)胞狀態(tài)表現(xiàn)出LE標(biāo)記物KLK2、KLK3、ACPP和NKX3-1的表達(dá)更高的情況（圖3h），且club標(biāo)記物PIGR、MMP7、CP和LTF在所有club細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于LE群體（圖3h）?？傊?，與正常前列腺club相比，前列腺癌club細(xì)胞具有更高的雄激素信號(hào)，并富集LTFhigh和NKX3-1high腔樣細(xì)胞狀態(tài)（圖3i）。
圖3 鑒定具有上調(diào)雄激素反應(yīng)特征的前列腺癌富含的club細(xì)胞狀態(tài)
4.BE和LE細(xì)胞的整合鑒定了前列腺癌樣本中富含的腫瘤相關(guān)細(xì)胞狀態(tài)
腔內(nèi)樣club細(xì)胞狀態(tài)的發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)作者研究前列腺癌樣本BE細(xì)胞群中是否存在類似細(xì)胞狀態(tài)。因此，作者將前列腺癌樣本BE細(xì)胞（BE PCa）與正常樣本BE細(xì)胞（BE normal）進(jìn)行整合，確定了9個(gè)細(xì)胞簇（圖4a），而所有9個(gè)細(xì)胞簇在BE PCa和BE Normal細(xì)胞中都有，細(xì)胞簇6在PCa樣本中顯著富集，而細(xì)胞簇4在正常樣本中富集（圖4b）。雄激素反應(yīng)通路、雌激素通路、胰島素信號(hào)通路和C2CP相關(guān)的癌癥KEGG通路顯著上調(diào)（圖4d）。AR通路成員是細(xì)胞簇6的主要標(biāo)志物（圖4e）。雖然在上皮細(xì)胞中BE簇6并沒有與其他BE細(xì)胞聚集，但作者推測(cè)BE細(xì)胞簇6可能代表了BE/LE細(xì)胞的中間狀態(tài)（圖4f）。BE細(xì)胞簇6中唯一顯著不同是腔內(nèi)標(biāo)記物高表達(dá)（圖4g），盡管與前列腺癌LE細(xì)胞相比，表達(dá)水平較低。此外，作者發(fā)現(xiàn)BE細(xì)胞簇6在雄激素反應(yīng)和LE評(píng)分中顯著上調(diào)（圖4h），表明這種細(xì)胞狀態(tài)可能是一種與前列腺癌相關(guān)的腔樣狀態(tài)。
圖4 BE和LE細(xì)胞整合鑒定了前列腺癌樣本中富含的腫瘤相關(guān)細(xì)胞狀態(tài)
5.整合上皮細(xì)胞分析揭示前列腺癌樣本中AR信號(hào)上調(diào)
為了描述前列腺樣本中全部上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征，作者整合了所有前列腺上皮細(xì)胞和先前正常健康對(duì)照的前列腺上皮細(xì)胞（圖5a）。作者在所有三種主要類型的上皮細(xì)胞（LE、BE和club細(xì)胞）中鑒定了腫瘤和正常樣本之間的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)FOS、JUN和PSAP是所有細(xì)胞中普遍上調(diào)的基因（圖5b）。在BE和club細(xì)胞中兩個(gè)前列腺癌富集的細(xì)胞與其他BE和club細(xì)胞相比，AR通路明顯上調(diào)。作者測(cè)試綜合數(shù)據(jù)集中AR表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在前列腺癌上皮細(xì)胞中，21.4% BE、28.6%的club、52.7%的LE、43.2%腫瘤細(xì)胞為AR+，與正常樣本中相同類型的細(xì)胞相比顯著升高（圖5c）。作者還計(jì)算了所有細(xì)胞的雄激素反應(yīng)通路評(píng)分，發(fā)現(xiàn)與正常樣本相比，前列腺癌樣本中三種主要上皮細(xì)胞類型AR信號(hào)上調(diào)（圖5c）。BE的AR得分僅與BE細(xì)胞簇6呈顯著正相關(guān)，club細(xì)胞AR打分與club細(xì)胞簇0呈顯著正相關(guān)（圖5d）。在RNA-seq數(shù)據(jù)集中，AR打分與BE細(xì)胞簇6和club細(xì)胞簇0呈正相關(guān)（圖5e），這也使作者確定了BE細(xì)胞和club細(xì)胞狀態(tài)，且它們雄激素反應(yīng)和前列腺癌關(guān)系更密切。
圖5 前列腺癌和正常上皮細(xì)胞的整合揭示了由前列腺癌富集的BE和club細(xì)胞狀態(tài)驅(qū)動(dòng)AR信號(hào)上調(diào)
6.ERG+腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜具有患者特異性，而ERG-腫瘤細(xì)胞與周圍LE細(xì)胞重疊
在所有上皮細(xì)胞聚類分析中，ERG+腫瘤細(xì)胞與非惡性LE細(xì)胞是獨(dú)立的，而ERG-腫瘤細(xì)胞與非惡性LE細(xì)胞更接近（圖2c）。作者首先分別分析了ERG+和ERG-腫瘤細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)確定了不同細(xì)胞狀態(tài)（圖6a，b）。ERG+腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)患者特異性，而在ERG-腫瘤細(xì)胞中沒有這種模式，因?yàn)榇蠖鄶?shù)ERG-腫瘤細(xì)胞不僅在一個(gè)患者中存在（圖6c）。作者觀察到ERG+腫瘤細(xì)胞與非惡性LE細(xì)胞有明顯不同，而ERG-腫瘤細(xì)胞與非惡性LE細(xì)胞沒有明顯區(qū)別（圖6d）。ERG-腫瘤細(xì)胞沒有觀察到患者特異性（圖6e）。在兩組數(shù)據(jù)集中，TMPRSS2-ERG融合狀態(tài)與ERG+腫瘤細(xì)胞評(píng)分顯著正相關(guān)，TMPRSS2-ERG融合缺失與ERG-腫瘤評(píng)分顯著負(fù)相關(guān)（圖6f）。這些結(jié)果支持腫瘤細(xì)胞的特征和使用ERG表達(dá)作為分類注釋腫瘤細(xì)胞。BE、LE和club細(xì)胞GSEA分析存在不同（圖6g）。
圖6 ERG+和ERG-腫瘤細(xì)胞的比較揭示了患者特異性細(xì)胞狀態(tài)和患者之間異質(zhì)性
7.T細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分析揭示了ERG-患者的共同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
ERG+和ERG-腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組差異表明，它們可能在腫瘤微環(huán)境中引起不同的反應(yīng)。為了確定腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞，以及特定免疫細(xì)胞是否在ERG+或ERG-樣本中存在差異，作者分析了T細(xì)胞群，并根據(jù)差異表達(dá)基因確定了CD4和CD8 T細(xì)胞、Treg和NK細(xì)胞（圖7a）。然后，作者根據(jù)ERG狀態(tài)對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行分群，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)CD4 T細(xì)胞群。在發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)CD4 T細(xì)胞集群中，CD4 T細(xì)胞群1在ERG+患者中富集（圖7b），并以高表達(dá)FOSB、FOS和JUN為特征。CD4 T細(xì)胞群2在ERG-患者中富集（圖7b），并以高表達(dá)CXCR6和DUSP4為標(biāo)志（圖7b）。同樣，作者根據(jù)患者ERG狀態(tài)對(duì)基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分群，并確定了包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞（圖7c）。在這三種基質(zhì)細(xì)胞中，成纖維細(xì)胞在ERG+患者中富集（圖7d）。為了檢測(cè)ERG-和ERG+患者腫瘤細(xì)胞之間的差異可能驅(qū)動(dòng)不同基質(zhì)細(xì)胞群和免疫反應(yīng)，作者在ERG-和ERG+腫瘤細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間進(jìn)行了GSEA分析，并計(jì)算了ERG-患者中顯著上調(diào)基因集的交集。在ERG-腫瘤細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了14個(gè)上調(diào)基因集（圖7e）。對(duì)于club細(xì)胞，在ERG-患者中沒有發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)或下調(diào)的通路（圖7f）。ERG-患者中常見的14個(gè)上調(diào)基因集包括PD-1反應(yīng)組和IFN-γ信號(hào)反應(yīng)組（圖7g），據(jù)報(bào)道這兩種基因在晚期前列腺癌中均上調(diào)。CD4 T細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中HLA基因家族的表達(dá)明顯高于ERG+細(xì)胞群（圖7g）。
圖7 CD4 T細(xì)胞群與ERG狀態(tài)和ERG-腫瘤微環(huán)境中PD-1和IFN-γ信號(hào)通路上調(diào)有關(guān)
8.前列腺癌類器官中含有上皮細(xì)胞，在BE細(xì)胞和club細(xì)胞中具有獨(dú)特的擴(kuò)張細(xì)胞狀態(tài)
為了建立模型來確定單細(xì)胞分析揭示的細(xì)胞狀態(tài)異質(zhì)性，并確定是否可以重建和繁殖前列腺癌相關(guān)club細(xì)胞，作者使用已建立的方法從6名接受局限性前列腺切除術(shù)的患者單細(xì)胞中獲得局限性前列腺癌類器官，并在三次傳代內(nèi)使用scRNA-seq對(duì)其進(jìn)行表征分析?；趶那傲邢俳M織樣本和正常樣本中生成的細(xì)胞類型，共確定了6種上皮細(xì)胞（圖8a）。為了證實(shí)在類器官中恢復(fù)了細(xì)胞類型多樣性，對(duì)KRT8+腔細(xì)胞和KRT5+基底細(xì)胞進(jìn)行了免疫熒光染色（圖8b），通過對(duì)SCGB1A1和LTF染色驗(yàn)證club細(xì)胞體外增殖能力，該蛋白在scRNA-seq鑒定的前列腺癌club細(xì)胞中上調(diào)（圖8b）。為了測(cè)試類器官可以作為腫瘤組織模型的保真度，作者將早期傳代（P0-P3）類器官樣本中的細(xì)胞與來自類器官的4個(gè)根治性前列腺切除術(shù)樣本上皮細(xì)胞整合在一起（圖8c）。對(duì)于4種來自患者的類器官，與親本組織相比，只有少量腫瘤細(xì)胞被捕獲。然而“丘細(xì)胞”、MSCs和MKI67+上皮細(xì)胞只存在于類器官樣本中，在前列腺癌組織樣本中未觀察到（圖8d）。BE標(biāo)記物KRT5、DST和KRT15在來自組織和類器官的BE群體中表達(dá)，而club細(xì)胞基因MMP7、LCN2和CP在兩個(gè)club細(xì)胞群體中均表達(dá)（圖8e），表明組織和類器官BE和club細(xì)胞之間存在相似性。類似地，當(dāng)用前列腺癌組織中club細(xì)胞分析類器官club細(xì)胞時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)共有8個(gè)獨(dú)特細(xì)胞簇，并在類器官樣本中觀察到細(xì)胞狀態(tài)擴(kuò)展（圖8f）。相反，細(xì)胞簇7包括了ACPP、NKX3-1、KLK2和KLK3等LE標(biāo)記，這與之前發(fā)現(xiàn)的前列腺癌富集的club細(xì)胞狀態(tài)特征相一致（圖8g）。
圖8 體外類器官樣本含有豐富的前列腺癌BE和club細(xì)胞狀態(tài)
結(jié)論：
總之，本文提供了局限性前列腺癌的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，以確定和突出與前列腺癌發(fā)生相關(guān)的多細(xì)胞環(huán)境和細(xì)胞狀態(tài)。研究結(jié)果為前列腺癌相關(guān)的上皮微環(huán)境和細(xì)胞狀態(tài)變化提供了見解，從而改善了前列腺癌的診斷。
參考文獻(xiàn)：
Song H, Weinstein H N W, Allegakoen P, et al. Single-cell analysis of human primary prostate cancer reveals the heterogeneity of tumor-associated epithelial cell states[J]. Nat Commun. 2022,13(1):141.
