掃碼聯(lián)系客服
今天給大家分享的是2022年2月份發(fā)表在Briefings in Bioinformatics（IF=13.994）一篇文章，文章主要講解了一種能夠精準(zhǔn)識別特異性亞細(xì)胞群的計(jì)算方法。
LRcell: detecting the source of differential expression at the sub-cell-type level from bulk RNA-seq data
LRcell：從RNA-seq數(shù)據(jù)中在亞細(xì)胞水平上檢測差異表達(dá)來源
1.摘要：
鑒于大多數(shù)組織由豐富多樣的（亞）細(xì)胞類型組成，RNA-seq分析中一個(gè)重要但尚未解決的問題是確定差異表達(dá)發(fā)生在哪些（亞）細(xì)胞類型上。單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）技術(shù)可以回答這個(gè)問題，但它們通常是費(fèi)力費(fèi)錢。在這里，作者介紹了LRcell，這是一種旨在識別在RNA-seq實(shí)驗(yàn)中觀察到變化的特定（亞）細(xì)胞類型的計(jì)算方法。此外，LRcell提供了從scRNA-seq實(shí)驗(yàn)計(jì)算的預(yù)嵌入標(biāo)記基因作為執(zhí)行分析的選項(xiàng)。作者進(jìn)行了一項(xiàng)模擬研究，以證明LRcell的有效性和可靠性。使用三個(gè)不同的真實(shí)數(shù)據(jù)集，作者表明LRcell成功識別出與精神疾病有關(guān)的已知細(xì)胞類型。將LRcell應(yīng)用于RNA-seq結(jié)果可以產(chǎn)生一種關(guān)于哪些（亞）細(xì)胞類型有助于差異表達(dá)的假設(shè)。LRcell是對細(xì)胞類型反卷積方法的補(bǔ)充。
2.研究背景
在實(shí)驗(yàn)條件之間尋找差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEG）是了解表型變異分子基礎(chǔ)的有力方法。然而，大多數(shù)組織由數(shù)十甚至數(shù)百種不同的（亞）細(xì)胞類型組成，而DEG可能只出現(xiàn)在這些（亞）細(xì)胞類型的一小部分中，這與實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)。RNA-seq數(shù)據(jù)無法揭示驅(qū)動(dòng)DEG的（亞）細(xì)胞類型。單細(xì)胞技術(shù)的快速發(fā)展和普及導(dǎo)致來自不同組織類型的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)（scRNA-seq）的大量積累。這些數(shù)據(jù)揭示了不同細(xì)胞類型之間轉(zhuǎn)錄調(diào)控的巨大差異，并為重要生物過程的修飾提供了前所未有的近距離視角，特別是對于疾病病理學(xué)，包括哪些細(xì)胞類型驅(qū)動(dòng)DEG。例如，在最近對阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的單細(xì)胞分析中，Mathys等人確定了響應(yīng)AD病理學(xué)的神經(jīng)膠質(zhì)-神經(jīng)元相互作用。在另一項(xiàng)單細(xì)胞研究中，Ruzicka等人發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元是精神分裂癥受影響最大的細(xì)胞類型。
在過去的10年中，許多計(jì)算細(xì)胞類型去卷積方法已經(jīng)被開發(fā)出來，它們能從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中推斷不同（亞）細(xì)胞類型的比例，還進(jìn)行了基準(zhǔn)研究以比較它們的性能。在這項(xiàng)研究中，作者提出了一種名為LRcell的新型計(jì)算工具。鑒于RNA-seq差異表達(dá)（differential expression，DE）的研究結(jié)果，LRcell的目標(biāo)是描繪組織的哪些（亞）細(xì)胞類型在兩種實(shí)驗(yàn)條件之間發(fā)生了重大變化。LRcell是在假設(shè)兩種實(shí)驗(yàn)條件之間的一種或幾種亞細(xì)胞類型發(fā)生的表達(dá)變化是在大塊組織水平觀察到的DEG主要貢獻(xiàn)者假設(shè)下開發(fā)的。細(xì)胞類型反卷積方法并非旨在推斷此類變化。利用從公開數(shù)據(jù)中獲得的scRNA-seq中鑒定的細(xì)胞類型特異性標(biāo)記基因，LRcell通過查找組織中所有（亞）細(xì)胞類型的標(biāo)記基因富集程度來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)（圖1）。因此，scRNA-seq實(shí)驗(yàn)不需要匹配RNA-seq實(shí)驗(yàn)條件。當(dāng)將LRcell應(yīng)用于各種RNA-seq差異表達(dá)時(shí)，作者成功地識別出與精神疾病發(fā)病機(jī)制有關(guān)的已知（亞）細(xì)胞類型，并產(chǎn)生可測試的新假設(shè)，這些假設(shè)有可能產(chǎn)生新的生物學(xué)見解。
圖1 LRcell工作流程。LRcell從對照病例的特定組織RNA-seq實(shí)驗(yàn)中提取結(jié)果作為輸入。為了便于說明，假設(shè)組織中有三種（亞）細(xì)胞類型，LRcell可以考慮從這三種（亞）細(xì)胞類型的scRNA-seq實(shí)驗(yàn)中獲得標(biāo)記基因。將標(biāo)記基因映射到整個(gè)基因列表中，按照DE p值排序。接下來，對于每種組織類型，應(yīng)用回歸分析。當(dāng)以標(biāo)記基因的二元指標(biāo)作為響應(yīng)變量時(shí)，作者進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸（LR）；當(dāng)使用Marques等人的方法產(chǎn)生的標(biāo)記基因富集分?jǐn)?shù)作為響應(yīng)變量時(shí)，作者進(jìn)行線性回歸（LiR）。在這兩種情況下，解釋變量是-log轉(zhuǎn)化后的DE p值。接下來，計(jì)算回歸分析的顯著性，并將其轉(zhuǎn)換為-log變換FDR并繪制曲線。在本例中，LRcell結(jié)果顯示A型細(xì)胞最顯著，說明A型細(xì)胞在對照病例實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮重要作用。
3.結(jié)果和討論
在這項(xiàng)工作中，作者從多個(gè)已發(fā)布的scRNA-seq數(shù)據(jù)集中收集并整理了一系列標(biāo)記基因。然后，對多個(gè)RNA-seq DE實(shí)驗(yàn)進(jìn)行LRcell分析，以證明其實(shí)用性。
3.1標(biāo)記基因收集和來源
在一種（亞）細(xì)胞類型與其天然狀態(tài)下的其他細(xì)胞類型之間表現(xiàn)出顯著差異的基因被視為標(biāo)記基因。與基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）的基因集類似，LRcell需要一份高質(zhì)量細(xì)胞類型標(biāo)記基因的綱要。目前，LRcell軟件包為用戶提供了來自人類血液、人類大腦和小鼠大腦的多個(gè)標(biāo)記基因集（圖2A），這些標(biāo)記基因集是使用Marques等人研究中介紹的方法從scRNA-seq數(shù)據(jù)集計(jì)算而來的。此外，LRcell軟件包提供由分子特征數(shù)據(jù)庫（Molecular Signatures Database，MSigDB）收集的具有特定標(biāo)準(zhǔn)的外部細(xì)胞標(biāo)記。外部標(biāo)記均來自人類物種，包括中腦、臍帶血、卵巢和骨骼肌。作者將所有細(xì)胞類型特異性標(biāo)記基因集存儲到另一個(gè)名為LRcell Type Markers的R Bioconductor Experiment Hub包中。
圖2 LRcell數(shù)據(jù)集和標(biāo)記基因在大腦不同區(qū)域重疊。（A）標(biāo)記基因已預(yù)先嵌入LRcell的所有組織類型的總結(jié)。（B）來自小鼠全腦scRNA-seq數(shù)據(jù)集的熱圖說明了FC區(qū)域內(nèi)細(xì)胞類型之間標(biāo)記基因的重疊。以小膠質(zhì)細(xì)胞為例說明這三種（亞）細(xì)胞類型之間的相似性。（C）顯示FC細(xì)胞類型和小腦CB細(xì)胞類型之間標(biāo)記基因重疊的熱圖。（D）顯示FC細(xì)胞類型和海馬細(xì)胞類型之間標(biāo)記基因重疊的熱圖。
3.2選定標(biāo)記基因的特性
由于Marques等人提出的方法不考慮DEG倍數(shù)變化，因此探索所選標(biāo)記基因所表現(xiàn)出的倍數(shù)變化是有意義的。計(jì)算了它們所代表的（亞）細(xì)胞類型中每個(gè)標(biāo)記基因相對于其他細(xì)胞類型的倍數(shù)變化，并繪制了每種（亞）細(xì)胞類型的log10轉(zhuǎn)換倍數(shù)變化。作者觀察到絕大多數(shù)這些標(biāo)記基因顯示出對某些神經(jīng)元（亞）細(xì)胞類型的預(yù)期顯著變化。
3.3模擬設(shè)置
由于DEG和細(xì)胞類型比例變化的基本事實(shí)難以監(jiān)測和跟蹤，作者進(jìn)行了模擬研究以證明LRcell的有效性。在這項(xiàng)模擬研究中，作者考慮了患者和對照之間的實(shí)驗(yàn)，涉及DEG和比例變化。作者模擬單細(xì)胞和大量RNA-seq數(shù)據(jù)。這兩種類型的數(shù)據(jù)都是由scDesign2使用成年小鼠額葉皮層（frontal cortex，F(xiàn)C）scRNA-seq數(shù)據(jù)集作為參考生成的，作者使用之前從數(shù)據(jù)集中獲得的標(biāo)記基因來進(jìn)行LRcell分析。為簡單起見，作者在模擬研究中考慮了兩種情況：（1）在條件變化期間所有（亞）細(xì)胞類型的比例保持不變，并且在一種特定的細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)了DEG；（2）病例和對照的（亞）細(xì)胞類型比例不同，在任何（亞）細(xì)胞類型中均未發(fā)現(xiàn)DEG。在每種情況下，作者都嘗試模擬不同的組合。在第一種情況下，作者考慮以下設(shè)置：（a）細(xì)胞類型比例分布；（b）細(xì)胞總數(shù)；（c）在該特定（亞）細(xì)胞類型中出現(xiàn)的DEG數(shù)量；（d）DEGs的倍數(shù)變化方向。在第二種情況下，作者考慮以下組合：（a）細(xì)胞類型比例分布；（b）細(xì)胞總數(shù)；（c）特定（亞）細(xì)胞類型的比例變化。此外，當(dāng)有更多（亞）細(xì)胞類型時(shí)，為了推動(dòng)LRcell性能范圍，作者模擬了有5、10和15個(gè)（亞）細(xì)胞類型的情況，并改變了以各種方式均勻分布的基線比例。
3.4模擬結(jié)果
對于模擬研究，作者輪流改變每個(gè)單獨(dú)的（亞）細(xì)胞類型，然后運(yùn)行LRcell或MuSiC并跟蹤改變的（亞）細(xì)胞類型的等級作為性能指標(biāo)。因?yàn)樵诘谝环N情況下，沒有比例變化，所以作者不測試MuSiC的性能。LRcell能夠正確識別大多數(shù)（亞）細(xì)胞類型的變化。出現(xiàn)錯(cuò)誤識別的情況是DEG數(shù)最少的情況（換句話說，模擬1000個(gè)DEG時(shí)）。對于第二種情況，作者比較了LRcell、MuSiC和GSEA（使用標(biāo)記基因作為基因集）。作者觀察到MuSiC在所有設(shè)置下都表現(xiàn)穩(wěn)定，而LRcell會(huì)產(chǎn)生一些錯(cuò)誤。這是完全可以預(yù)料的，因?yàn)樵搱鼍胺螹uSiC的假設(shè)，但不符合LRcell的假設(shè)，因?yàn)樗皇羌?xì)胞類型比例反卷積方法。作者還在有更多（亞）細(xì)胞類型的情況下比較了LRcell、MuSiC和GSEA。作者注意到，當(dāng)有10種（亞）單元類型時(shí)，LRcell和MuSiC工作得同樣好，而當(dāng)有15種（亞）單元類型時(shí)，LRcell的表現(xiàn)略好于MuSiC。特別是，對于比例增加20%的1000個(gè)細(xì)胞的設(shè)置，LRcell和MuSiC都檢測到不正確但相似的（亞）細(xì)胞類型。在所有設(shè)置下，LRcell和MuSiC的表現(xiàn)都優(yōu)于GSEA。
3.5小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)退行性癡呆中高度富集
在模擬研究之后，作者在真實(shí)數(shù)據(jù)分析中進(jìn)行了LRcell。在最近的一項(xiàng)神經(jīng)退行性癡呆研究中，Swarup及其同事使用RNA-seq將表達(dá)tau突變體的TPR50小鼠與野生型小鼠進(jìn)行了對比，以識別介導(dǎo)癡呆的基因網(wǎng)絡(luò)（隨后的小鼠AD研究）。為了識別與該病癥最相關(guān)的細(xì)胞類型，作者使用來自成年小鼠FC區(qū)域的預(yù)嵌入標(biāo)記基因?qū)Rcell應(yīng)用于DEG列表。從LRcell結(jié)果，作者觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出高度顯著性（圖3A），這與之前的研究一致。此外，F(xiàn)C_11-3未知和FC_11–4未知（亞）細(xì)胞類型也顯示出高水平的顯著性。然而，所有細(xì)胞簇中標(biāo)記基因的成對比較表明，這兩個(gè)未知細(xì)胞簇與FC_11-1有相當(dāng)大的重疊，F(xiàn)C_11-1也是一種小膠質(zhì)細(xì)胞類型（圖2B），這解釋了作者觀察到的模式。
圖3 將LRcell應(yīng)用于實(shí)際案例。（A）LRcell將大量神經(jīng)退行性癡呆DEGs映射到小鼠大腦FC區(qū)域的結(jié)果。（B）使用LRcell（小鼠大腦FC）中的相同標(biāo)記基因作為輸入，繪制大面積神經(jīng)退行性癡呆DEGs的GSEA結(jié)果。（C）用MuSiC計(jì)算對照和疾病樣本的細(xì)胞類型比例。（D）LRcell將大量PTSD DEGs映射到人類PBMC的結(jié)果。（E）使用LRcell（人類PBMC）中的相同標(biāo)記基因作為輸入，GSEA結(jié)果將大量PTSD DEGs映射到人類PBMC。（F）用MuSiC計(jì)算對照和病例樣本的細(xì)胞類型比例。
3.6 CD16+單核細(xì)胞在創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙中高度富集
在最近的一項(xiàng)研究中，Breen及其同事使用從美國海軍陸戰(zhàn)隊(duì)收集的外周血白細(xì)胞進(jìn)行了一項(xiàng)大規(guī)模的全轉(zhuǎn)錄組研究，其中一些在部署后出現(xiàn)了創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（posttraumatic stress disorder，PTSD）（之后的人類PTSD研究）。使用這個(gè)數(shù)據(jù)集，作者生成了一個(gè)DEG列表，這些DEG顯示了PTSD組和對照組在部署前時(shí)間點(diǎn)之間的顯著差異。使用來自外周血單核細(xì)胞（PBMC）的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的人類標(biāo)記基因，LRcell分析發(fā)現(xiàn)注釋為CD16+非經(jīng)典單核細(xì)胞的細(xì)胞在PBMC的所有細(xì)胞類型中顯示為最重要的（圖3D）。作者的發(fā)現(xiàn)具有生物學(xué)意義，因?yàn)槿缦惹暗难芯克?，異質(zhì)性存在于由CD16表面蛋白區(qū)分的單核細(xì)胞中，非經(jīng)典單核細(xì)胞已被證實(shí)可調(diào)節(jié)創(chuàng)傷中的免疫反應(yīng)。
3.7來自不同地區(qū)或時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)記基因
要應(yīng)用LRcell，一個(gè)重要的問題是使用哪個(gè)標(biāo)記基因組，即如何選擇組織來源與轉(zhuǎn)錄組研究中描述的組織類型相匹配的單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)。這對于大腦等復(fù)雜組織尤為重要。為了解決這個(gè)問題，作者以小鼠AD研究為例，其中包含來自四個(gè)大腦區(qū)域的信息：皮質(zhì)、海馬（hippocampus，HC）、小腦（cerebellum，CB）和腦干。為了了解標(biāo)記基因如何在大腦區(qū)域之間變化，作者首先定義大腦所有區(qū)域的標(biāo)記基因以探索它們的空間模式（圖2C和D）。作者觀察到來自不同區(qū)域的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，例如星形膠質(zhì)細(xì)胞，具有更多的重疊標(biāo)記基因，這表明整個(gè)大腦的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的同質(zhì)性。相比之下，神經(jīng)元和中間神經(jīng)元在不同的大腦區(qū)域共享很少的標(biāo)記基因。然后，作者將來自FC、HC和CB的預(yù)嵌入成年小鼠腦標(biāo)記基因分別應(yīng)用于從皮層、HC和CB獲得的大量DEG。作者觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞在所有三個(gè)大腦區(qū)域都高度富集，而星形膠質(zhì)細(xì)胞的含量在CB中特別高。特別是當(dāng)CB標(biāo)記基因應(yīng)用于CB bulk DE實(shí)驗(yàn)時(shí)，作者注意到一種（亞）細(xì)胞類型的星形膠質(zhì)細(xì)胞比其他類型的細(xì)胞高度富集。作者的觀察表明，所選擇的細(xì)胞類型在空間上是異質(zhì)性的；這意味著標(biāo)記基因不僅對細(xì)胞類型具有高度特異性，而且對細(xì)胞所屬的區(qū)域也具有高度特異性。由于這一發(fā)現(xiàn)，使用位于緊密匹配的大腦區(qū)域的細(xì)胞類型標(biāo)記基因來運(yùn)行LRcell是非?？扇〉?。作者也很好奇從非正常樣本進(jìn)行的scRNA-seq實(shí)驗(yàn)中選擇的標(biāo)記基因是否可以作為參考。為了解決這個(gè)問題，作者使用了來自HIV疫苗研究的數(shù)據(jù)，作者觀察到細(xì)胞類型特異性標(biāo)記基因的表達(dá)在同一細(xì)胞類型（如CD8細(xì)胞）內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)上大多是一致的，并且在不同細(xì)胞類型之間是不同的。作者還嘗試使用從不同時(shí)間點(diǎn)收集的樣本中鑒定的標(biāo)記基因進(jìn)行LRcell分析，并觀察到富集信號幾乎相同。因此，盡管LRcell中使用的默認(rèn)標(biāo)記基因是從對照樣本中收集的，但作者認(rèn)為，當(dāng)來自正常樣本的scRNA-seq數(shù)據(jù)不可用時(shí)，從非正常樣本中鑒定的標(biāo)記基因是可以接受的。
3.8與GSEA的比較
GSEA是一個(gè)強(qiáng)大的工具，可以在比較兩種生物條件時(shí)確定預(yù)定義的基因集是否顯示出一致的表達(dá)變化。通過將細(xì)胞類型特異性標(biāo)記基因視為預(yù)定義的基因組，可以用GSEA代替LRcell來識別DEG驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞類型。為了比較這兩種方法的性能，作者使用GSEA重復(fù)小鼠AD研究和人類PTSD研究中所做的分析。GSEA結(jié)果來源于小鼠AD研究。小鼠AD研究的GSEA結(jié)果（圖3B）產(chǎn)生了幾種同樣重要的（亞）細(xì)胞類型，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、壁細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和多突膠質(zhì)細(xì)胞。關(guān)聯(lián)意義導(dǎo)致難以確定哪些（亞）細(xì)胞類型可能參與癡呆發(fā)病機(jī)制。在人類PTSD研究的GSEA結(jié)果中觀察到類似模式（圖3E），這表明單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和一些T（亞）細(xì)胞類型同樣豐富?；谏鲜鲇^察，作者得出結(jié)論，LRcell比GSEA更有效地識別在DE實(shí)驗(yàn)中受條件變化影響最大的（亞）細(xì)胞類型。
3.9 LRcell的特異性、魯棒性和運(yùn)行時(shí)間
評估LRcell是否表現(xiàn)出良好的特異性（即低假陽性率）是有意義的。為此，作者模擬了在任何（亞）細(xì)胞類型中都沒有顯著DEG的空場景。當(dāng)將LRcell應(yīng)用于這種空的RNA-seq數(shù)據(jù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)LRcell產(chǎn)生的結(jié)果要么沒有，要么更少，而且顯著性更弱，說明LRcell靈敏度良好。為了分析LRcell穩(wěn)健性，作者從兩個(gè)角度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：（i）標(biāo)記基因的數(shù)量是否強(qiáng)烈影響LRcell結(jié)果和（ii）不同的DEGs檢測方法是否影響LRcell結(jié)果。作者首先在人類PTSD研究中使用源自PBMC scRNA-seq數(shù)據(jù)集的不同標(biāo)記基因數(shù)進(jìn)行LRcell，作者得到了類似的富集性能，這表明了LRcell分析的穩(wěn)健性。除了DESeq2，使用Voom和Limma對小鼠AD研究和人類PTSD研究進(jìn)行DEG分析。在相同的標(biāo)記基因設(shè)置下，作者注意到富集模式與FC_11-1相似。小膠質(zhì)細(xì)胞與其他（亞）細(xì)胞類型一起高度富集。此外，作者分析了不同模擬場景下LRcell、GSEA和MuSiC之間的執(zhí)行時(shí)間，觀察到LRcell和GSEA穩(wěn)定快速，而MuSiC執(zhí)行時(shí)間隨著參考單元數(shù)量的增加而增加。
4.結(jié)論：
總之，作者利用新出現(xiàn)的scRNA-seq數(shù)據(jù)開發(fā)了LRcell，這是一個(gè)R Bioconductor包，利用新出現(xiàn)的scRNA-seq數(shù)據(jù)，識別在比較轉(zhuǎn)錄組研究中驅(qū)動(dòng)變化的（亞）細(xì)胞類型。LRcell的基本原理是相信修飾細(xì)胞類型的標(biāo)記基因傾向于向DEG列表的頂部（或底部）富集。作者在各種實(shí)驗(yàn)條件下應(yīng)用LRcell進(jìn)行全面調(diào)查，并成功識別在小鼠AD研究和人類PTSD研究中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞類型。因此，作者相信LRcell可以為研究人員在（亞）細(xì)胞類型水平的生物學(xué)變化來源提供重要的和新的生物學(xué)見解，而無需進(jìn)行昂貴且費(fèi)力的scRNA-seq實(shí)驗(yàn)。作者從模擬數(shù)據(jù)和真實(shí)數(shù)據(jù)中得出的結(jié)果表明，LRcell與細(xì)胞類型去卷積方法是互補(bǔ)的。因此，作者建議將LRcell納入RNA-seq分析，以全面了解復(fù)雜組織內(nèi)（亞）細(xì)胞類型水平發(fā)生的變化。
參考文獻(xiàn)：Ma W, Sharma S, Jin P, et al. LRcell: detecting the source of differential expression at the sub-cell-type level from bulk RNA-seq data[J]. Brief Bioinform. 2022,23(3):1-11.
