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今年3月1日發(fā)表在Cancer Discovery（IF：38.272）的一篇文章，發(fā)現(xiàn)了一種以前未被識別的泛素連接酶復(fù)合物，BICR6模塊。通過泛素化和抑制HRI（血紅素調(diào)節(jié)抑制劑，綜合應(yīng)激反應(yīng)適應(yīng)途徑的一個組成部分），選擇性地促進具有高度非整倍體的上皮腫瘤亞群的存活。小編通讀了整篇文章之后想到了很多個生信可以研究的思路，不知道優(yōu)秀的你是不是也能get到其中的關(guān)鍵呢~
下面我們詳細看一下：
A Ubiquitination Cascade Regulating the Integrated Stress Response and Survival in Carcinomas
調(diào)節(jié)癌癥綜合應(yīng)激反應(yīng)和生存的泛素級聯(lián)
背景
突變癌基因小分子抑制劑的鑒定在某些情況下導(dǎo)致了顯著的腫瘤反應(yīng)。盡管取得了這些成功，但許多癌癥并沒有藥物致癌基因突變，單藥治療很少導(dǎo)致腫瘤完全消退。綜合應(yīng)激反應(yīng)（ISR）是一種由多種應(yīng)激信號激活的信號級聯(lián)，支持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的維持。許多不同的應(yīng)激刺激，包括氧化應(yīng)激、病毒感染、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激、線粒體失調(diào)和氨基酸缺失，集中于四種激酶之一的激活：血紅素調(diào)節(jié)抑制劑（HRI，也稱為EIF2 AK1）、蛋白激酶R（PKR）、蛋白激酶R樣ER激酶（PERK）、或general control nonderepressible 2（GCN2）。一旦激活，這些激酶介導(dǎo)真核翻譯起始因子2（eIF2）的磷酸化和失活，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的普遍減少。以前的研究已經(jīng)證明了癌癥中ISR信號的異常激活及其對癌癥發(fā)病機制的貢獻。然而，這些研究并沒有解決該途徑的選擇性激活是否會導(dǎo)致癌癥的獨特脆弱性。
在這里，作者分析了一個由CRISPR–Cas9功能喪失篩查組成的癌癥依賴性數(shù)據(jù)集，該篩查在1086個癌癥細胞系中進行，以確定同質(zhì)基因模塊。該方法確定了癌癥細胞系亞群適應(yīng)度所需的蛋白復(fù)合物和信號通路，其中包括一種以前未被識別的功能性泛素連接酶復(fù)合物，通過阻止這些細胞中ISR的過度激活，使部分上皮性癌癥細胞存活。這項研究揭示了一種新的ISR調(diào)節(jié)機制，以及與癌癥細胞中ISR激活相關(guān)的潛在可利用漏洞。
結(jié)果
通過同源性分析識別BIRC6泛素化模塊
為了確定選擇性必需的信號通路或蛋白質(zhì)復(fù)合物，作者試圖找到在大量癌癥細胞系中表現(xiàn)出同質(zhì)性特征的基因簇，以下稱為同質(zhì)性模塊?；谙嚓P(guān)性的顯著性和重要性的方差，作者選擇了50個頂級同源基因模塊（圖1A）。在這50個同質(zhì)性模塊中，蛋白質(zhì)復(fù)合物和信號通路先前與特定癌癥類型的發(fā)病機制有關(guān)（圖1A），這證實該方法確定了對特定癌癥生存至關(guān)重要的通路。作者還鑒定了迄今未被識別的共本質(zhì)復(fù)合物，包括由四個參與蛋白質(zhì)泛素化的基因組成的模塊：UBA6、BIRC6、KCMF1和UBR4，將這些共本質(zhì)基因稱為BIRC6模塊。這四個基因不僅在CRISPR篩查數(shù)據(jù)集中密切相關(guān)，而且在707個癌癥細胞系中進行的基因組規(guī)模RNAi篩查數(shù)據(jù)集中也密切相關(guān)（圖1B）。
為了進一步評估BIRC6模塊基因作為選擇性和可利用的癌癥脆弱性的潛力，作者分別檢查了這些基因的重要性特征，結(jié)果顯示四個基因都表現(xiàn)出高方差和強表型的重要性特征（圖1C，D）。上皮衍生細胞系通常比間充質(zhì)組織衍生癌癥細胞系更依賴BIRC6模塊，并且對該模塊的依賴性在乳腺癌、頭頸癌和食管癌中尤其豐富（圖1E，F(xiàn)）。
BIRC6依賴性的體外和體內(nèi)驗證
經(jīng)過細胞活力測定發(fā)現(xiàn)，這些基因的耗盡降低了依賴細胞系的增殖和存活，其程度顯著大于非依賴細胞系。BIRC6耗竭對細胞適應(yīng)性的強烈影響，以及BIRC6依賴性的選擇性分布，表明它是該模塊的關(guān)鍵組成部分。盡管BIRC6敲除顯著降低了所有依賴細胞系中的細胞生存能力，但對非依賴細胞系的影響與切割對照的影響相似（圖2A）。正交試驗結(jié)果顯示BIRC6的耗盡導(dǎo)致依賴細胞系中選擇性地降低了細胞活力（圖2B）。這些觀察結(jié)果表明，BIRC6在癌癥細胞亞群中是選擇性必需的，并且這種E2連接酶在至少某些類型的非轉(zhuǎn)化細胞中是可有可無的。
為了深入了解BIRC6耗竭影響細胞生存能力的機制，作者評估了三種依賴性和三種非依賴性細胞系中BIRC6敲除后的細胞周期概況和凋亡水平，發(fā)現(xiàn)BIRC6耗竭導(dǎo)致三種依賴性細胞系中S期細胞的比例一致降低，但三種非依賴性細胞卻沒有降低（圖2C），所有三種依賴性但只有一種非依賴性細胞系中都誘導(dǎo)了早期和晚期凋亡（圖2D）。因此，BIRC6抑制影響依賴細胞系的增殖和存活。
在體外證實了BIRC6的選擇性重要性后，作者試圖評估體內(nèi)BIRC6抑制的效果，特別是對腫瘤生長和維持的影響。首先，生成了一種靶向BIRC6的多西環(huán)素誘導(dǎo)的短發(fā)夾RNA引入到ZR751細胞（雌激素受體陽性乳腺癌癥細胞系）中，并制備腫瘤模型。在多西環(huán)素喂養(yǎng)的小鼠組中觀察到BIRC6敲除后的穩(wěn)健腫瘤消退（圖2E）。類似地，BIRC6非依賴性食管癌癥模型小鼠，BIRC6的缺失無法改變腫瘤的生長速度（圖2F）。相反，與對照組相比，BIRC6依賴性肺癌模型小鼠BIRC6的缺失導(dǎo)致原發(fā)性腫瘤的快速消退和肺和肝臟轉(zhuǎn)移負擔(dān)的顯著降低（圖2G）。這些觀察結(jié)果表明BIRC6是一種高度選擇性依賴、對不同癌癥譜系的體內(nèi)腫瘤生長有強烈影響。
BIRC6模塊的生化研究
BIRC6是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的成員，具有獨特的泛素結(jié)合（UBC）結(jié)構(gòu)域。為了評估觀察到的對BIRC6的依賴性是否需要BIR和/或UBC結(jié)構(gòu)域，作者開發(fā)了一種競爭分析，其中直接比較了兩種不同細胞群體的增殖/存活情況：一種含有沉默突變，另一種攜帶破壞BIR或UBC功能域的破壞性突變。
實驗結(jié)果顯示，UBC結(jié)構(gòu)域賦予的BIRC6 E2泛素結(jié)合酶功能，而不是BIR結(jié)構(gòu)域功能，對依賴細胞的生存至關(guān)重要（圖3A，B）。并且UBA6（E1）、BIRC6（E2）和KCMF1/UBR4（E3）之間存在物理相互作用，并表明這些成員共同形成泛素連接酶復(fù)合物，其功能反過來對一部分上皮性癌癥細胞的增殖/存活至關(guān)重要（圖3C-F）。
BIRC6耗盡后ISR的激活
為了了解BIRC6選擇性依賴的機制基礎(chǔ)，作者研究了BIRC6抑制引起的轉(zhuǎn)錄變化。在依賴細胞系模型中，BIRC6抑制后，700多個基因的表達發(fā)生了顯著變化（圖4A）。與G2–M檢查點進展相關(guān)的基因和E2F靶基因的下調(diào)，以及與凋亡相關(guān)的基因的上調(diào)。參與未折疊蛋白應(yīng)答（UPR）的基因僅在依賴BIRC6表達生存的細胞系中高度上調(diào)（圖4B）。并且UPR的p-eIF2β/ATF4臂在BIRC6依賴和非依賴細胞中都是完整的（圖4C）。但是，沒有發(fā)現(xiàn)ATF6和IRE1/XBP1（UPR另外的兩個獨立信號）通路激活的跡象，這兩個UPR分支的靶基因沒有顯著上調(diào)（圖4D）。這些觀察表明p-eIF2α/ATF4信號的選擇性激活是依賴細胞中BIRC6復(fù)合物抑制的共同結(jié)果。
UPR的典型激活涉及ER駐留激酶PERK誘導(dǎo)p-eIF2α/ATF4信號傳導(dǎo)。然而，這種p-eIF2α/ATF4信號通路也可以被其他三種eIF2α激酶中的任何一種激活：HRI、PKR和GCN2（圖4E）。這些eIF2α激酶的應(yīng)激依賴性激活及其隨后觸發(fā)p-eIF2α/ATF4信號的能力統(tǒng)稱為ISR。也就是說，BIRC6泛素連接酶復(fù)合物的阻斷導(dǎo)致ISR的選擇性激活。
BIRC6抑制后HRI觸發(fā)ISR
為了測試在抑制BIRC6復(fù)合物時觀察到的生存能力喪失是否需要ISR激活，作者使用了一種小分子ISR抑制劑（ISRIB）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ISRIB處理不僅恢復(fù)了ISR激活的下游效應(yīng)，包括ATF4和ATF3的誘導(dǎo)（圖5A），還挽救了UBA6、BIRC6、KCMF1和UBR4耗竭導(dǎo)致的生存能力損失（圖5B）。
為了闡明BIRC6耗竭與ISR激活之間的聯(lián)系，作者進行了基因組規(guī)模的CRISPR–Cas9功能缺失篩查，以確定BIRC6依賴性的抑制劑，結(jié)果證實了在BIRC6耗竭時對HRI的選擇性要求（圖5C-E）。為了確認HRI（而不是其他eIF2α激酶）的耗竭是否挽救了BIRC6抑制導(dǎo)致的生存能力損失，作者首先使用CRISPR–Cas9基因靶向在HCC02和SNU503細胞中耗盡HRI或PERK，并測量了隨后BIRC6敲除對ISR激活和細胞生存能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HRI的耗竭（而不是PERK）阻斷了ISR激活，并損害了細胞活力的降低，所有這些都是在BIRC6敲除后強烈誘導(dǎo)的（圖5F和G）。這些結(jié)果表明HRI是將BIRC6復(fù)合物抑制與ISR激活聯(lián)系起來的關(guān)鍵效應(yīng)器。
BIRC6復(fù)合物泛素化HRI
為了確定BIRC6泛素連接酶復(fù)合物的推定靶點，并深入了解該復(fù)合物的抑制觸發(fā)HRI介導(dǎo)的ISR激活的機制，作者研究了BIRC6抑制對蛋白質(zhì)組的影響。ISRIB處理恢復(fù)了BIRC6耗竭引起的絕大多數(shù)蛋白質(zhì)組變化，包括許多ISR調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的表達（圖6A和B）。HRI分別是在不存在和存在ISR抑制劑（ISRIB）的情況下，BIRC6耗盡后第25和第3個顯著上調(diào)的蛋白（圖6A）。
泛素化級聯(lián)的其他成員（UBA6、KCMF1和UBR4）的耗盡和蛋白酶體抑制劑MG132的處理都導(dǎo)致這兩種細胞系中HRI表達升高（圖6C）。這些觀察結(jié)果排除了HRI上調(diào)是ISR激活導(dǎo)致的二次變化的可能性，并強化了HRI是BIRC6復(fù)合物的直接效應(yīng)者的觀點，將該復(fù)合物與ISR聯(lián)系起來。環(huán)己酰亞胺追蹤試驗檢查BIRC6敲除的后果，結(jié)果表明BIRC6耗盡導(dǎo)致HRI穩(wěn)定（圖6D）。但BIRC6的缺失減少了HRI泛素化的形式的出現(xiàn)（圖6E）。BIRC6的耗竭導(dǎo)致HCC202細胞中磷酸化和非磷酸化形式的HRI表達增加（圖6G）。這些觀察結(jié)果表明HRI是BIRC6復(fù)合物的直接泛素化/降解目標，并且BIRC6復(fù)合物可能通過穩(wěn)定這種激酶的表達而不是主動觸發(fā)其磷酸化來增強HRI的活性。
與這一概念一致，HRI的耗盡導(dǎo)致六種BIRC6依賴細胞系中多種ISR標記物（包括p-eIF2α、ATF4、ATF3和SESN2）的表達一致減少，但六種BILC6非依賴細胞系沒有減少（圖6H）。BIRC6依賴和非依賴細胞系之間HRI組成活性的差異表明，HRI的穩(wěn)態(tài)活性決定了BIRC6的依賴性。
BIRC6依賴性在高度非整倍體的腫瘤細胞中富集
最后，為了評估目前研究的信號級聯(lián)，即BIRC6泛素連接酶復(fù)合物→HRI降解→抑制HRI介導(dǎo)的ISR對人類癌癥的激活。作者分析了人類正常與腫瘤樣本中其產(chǎn)物直接參與該信號級聯(lián)的基因的表達水平。結(jié)果顯示，與正常樣本相比，HRI在腫瘤樣本中的表達顯著升高，表明高HRI表達的腫瘤細胞也需要高表達BIRC6復(fù)合物成分，以降解HRI并減輕HRI激活的ISR的影響，證實了目前研究的信號級聯(lián)與人類癌癥的相關(guān)性。作者生成并探索了另一個側(cè)重于癌癥相關(guān)遺傳變化的數(shù)據(jù)集，其中包括癌基因功能的獲得、抑癌基因功能喪失，以及與染色體異常和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等全球基因組變化相關(guān)的特征。分析揭示了非整倍體程度與BIRC6依賴性之間的顯著相關(guān)性（圖7A和B）。
事實上，BIRC6與UBA6和UBR4一起，是非整倍體分數(shù)高的細胞中最顯著的遺傳依賴性之一，整數(shù)分數(shù)從0到39，根據(jù)臂水平染色體增益和損失的數(shù)量分配給每個細胞系（圖7C）。一致地，具有高非整倍性分數(shù)的細胞系組比具有低非整倍度分數(shù)的細胞組更依賴BIRC6（圖7D）。類似地，最強烈依賴BIRC6的細胞系組表現(xiàn)出明顯高于最不依賴BIRC6的細胞系組（圖7E）。總之，這些觀察結(jié)果突出了非整倍體的程度與BIRC6的依賴性之間的強烈關(guān)聯(lián)，并表明了使用非整倍性來識別要通過BIRC6抑制策略治療的患者的潛力（圖7F）。
討論
更廣泛地說，這項研究提供了一種方法來識別新的非腫瘤驅(qū)動的癌癥靶點。本研究還整合了基因組工程、基因組規(guī)模抑制篩選和蛋白質(zhì)組分析，不僅鑒定了一種新的泛素連接酶，而且還解釋了這種BIRC6泛素連接酶調(diào)節(jié)ISR和細胞適應(yīng)性的機制。因此，這種方法提供了一種可靠的途徑來識別和證明致癌途徑和靶點，同時識別這些依賴性背后的機制，預(yù)計這種方法將為癌癥藥物開發(fā)開辟新的途徑。
最后新東西的產(chǎn)生往往代表著契機的出現(xiàn)，就看大家是不是有敏銳的“嗅覺”抓住這次機會。對BIRC6模塊或泛素化相關(guān)研究感興趣的小伙伴，趕緊掃描下方二維碼，千萬不要錯過啦~（有任何其他想法也都可以掃碼噢）
BIRC6泛素連接酶生信思路
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